2001/59/EG:  28.Anpassung 67/548/EWG

2001/59/EWG • Anhang 4

RICHTLINIE 2001/59/EG

DER KOMMISSION vom 6. August 2001 zur 28. Anpassung der Richtlinie 67/548/EWG des Rates zur Angleichung der Rechts- und Verwaltungsvorschriften der Mitgliedstaaten für die Einstufung, Verpackung und Kennzeichnung gefährlicher Stoffe an den technischen Fortschritt

  (Text von Bedeutung für den EWR) 

ANHANG 5A
EN: B.13/14. Mutagenicity Š reverse mutation test using bacteria.
(Betrifft nicht die ES-Sprachfassung)
(Betrifft nicht die DA-Sprachfassung)
(Betrifft nicht die DE-Sprachfassung)
(Betrifft nicht die EL-Sprachfassung)
(Betrifft nicht die FR-Sprachfassung)
(Betrifft nicht die IT-Sprachfassung)
(Betrifft nicht die NL-Sprachfassung)
(Betrifft nicht die PT-Sprachfassung)
(Betrifft nicht die FI-Sprachfassung)
(Betrifft nicht die SV-Sprachfassung)

ANHANG 5B
FR: L'administration du témoin positif par une voie différente de celle utilisée pour la substance d'essai est acceptable.
(Betrifft nicht die ES-Sprachfassung)
(Betrifft nicht die DA-Sprachfassung)
(Betrifft nicht die DE-Sprachfassung)
(Betrifft nicht die EL-Sprachfassung)
(Betrifft nicht die EN-Sprachfassung)
(Betrifft nicht die IT-Sprachfassung)
(Betrifft nicht die NL-Sprachfassung)
(Betrifft nicht die PT-Sprachfassung)
(Betrifft nicht die FI-Sprachfassung)
(Betrifft nicht die SV-Sprachfassung)

ANHANG 5C
EN: t(min) = Irradiation dose (J/cm 2 × 1 000)
Irradiance (mW/cm 2 × 60) (1 J = 1 W sec)
(Betrifft nicht die ES-Sprachfassung)
(Betrifft nicht die DA-Sprachfassung)
(Betrifft nicht die DE-Sprachfassung)
(Betrifft nicht die EL-Sprachfassung)
(Betrifft nicht die FR-Sprachfassung)
(Betrifft nicht die IT-Sprachfassung)
(Betrifft nicht die NL-Sprachfassung)
(Betrifft nicht die PT-Sprachfassung)
(Betrifft nicht die FI-Sprachfassung)
(Betrifft nicht die SV-Sprachfassung)

ANHANG 5D
B.26. PRÜFUNG AUF SUB-CHRONISCHE ORALE TOXIZITÄT
90-TAGE-TOXIZITÄTSSTUDIE BEI WIEDERHOLTER ORALER VERABREICHUNG AN NAGETIEREN
1. METHODE
Diese Methode zur Prüfung auf subchronische orale Toxizität entspricht der OECD TG 408 (1998).
1.1. EINLEITUNG
Bei der Beurteilung und Bewertung der toxischen Merkmale eines chemischen Stoffs kann die Bestimmung der
subchronischen Toxizität bei wiederholter oraler Verabreichung von Wirkstoffgaben durchgeführt werden,
nachdem erste Toxizitätsdaten anhand von Prüfungen auf akute Toxizität oder 28-Tage-Tests auf Toxizität bei
wiederholter Verabreichung erzielt wurden. Die 90-Tage-Studie liefert Informationen über mögliche gesund-
heitliche Schädigungen, die durch wiederholte Exposition über einen längeren Zeitraum, einschließlich der Ent-
wicklung nach dem Abstillen bis zum Erwachsensein, entstehen können. Die Studie liefert ferner Informatio-
nen über die wichtigsten toxischen Wirkungen, zeigt die Zielorgane und eine mögliche Akkumulation auf und
kann zur Ableitung einer NOAEL (NOAEL Š Dosis ohne beobachtete schädigende Wirkung) beitragen, die
zur Wahl der Dosierungen für Untersuchungen der chronischen Toxizität und zur Festlegung von Sicherheits-
kriterien für die Humanexposition herangezogen werden kann.
Die Methode legt außerdem den Schwerpunkt auf neurologische Endpunkte und liefert Hinweise auf immuno-
logische und fortpflanzungsspezifische Wirkungen. Ferner wird die Notwendigkeit sorgfältiger klinischer Beob-
achtung der Tiere hervorgehoben, um möglichst umfangreiche Informationen zu erhalten. Durch diese Studie
sollten chemische Stoffe mit potenzieller neurotoxischer und immunologischer Wirkung sowie Wirkung auf
die Fortpflanzungsorgane ermittelt werden, die gegebenenfalls weitergehende Untersuchungen erforderlich
machen.
Siehe auch Allgemeine Einleitung Teil B.
1.2. BEGRIFFSBESTIMMUNGEN
Dosis ist die Menge der verabreichten Prüfsubstanz. Die Dosis wird als Gewicht (g, mg) oder als Gewicht der Prüfsub-
stanz je Gewichtseinheit des Versuchstiers (z. B. mg/kg) oder als konstante Futterkonzentration (ppm) ausgedrückt.
Dosierung ist ein allgemeiner Begriff, der die Dosis, ihre Häufigkeit und die Dauer der Verabreichung umfasst.
NOAEL ist die Abkürzung für —no-observed adverse effect levelie und entspricht der höchsten Dosis, bei der keine schä-
digenden behandlungsbedingten Wirkungen festgestellt werden.
1.3. PRINZIP DER METHODE
Die Prüfsubstanz wird täglich über einen Zeitraum von 90 Tagen in abgestuften Dosen an mehrere Gruppen
von Versuchstieren verabreicht, und zwar eine Dosisstufe je Gruppe. Während des Verabreichungszeitraums
werden die Tiere sorgfältig auf Toxizitätsanzeichen beobachtet. Während der Prüfung verendete oder getötete
Tiere werden seziert. Am Ende der Prüfung werden alle noch lebenden Tiere getötet und ebenfalls seziert.
1.4. BESCHREIBUNG DER METHODE
1.4.1. Vorbereitung der Tiere
Zu verwenden sind gesunde Tiere, die mindestens fünf Tage an die Laborbedingungen gewöhnt und bisher
nicht für Tierversuche verwendet wurden. Von den Versuchstieren sollten Art, Stamm, Herkunft, Geschlecht,
Gewicht und/oder Alter festgestellt werden. Die Tiere werden nach dem Zufallsprinzip in Kontroll- und
Behandlungsgruppen eingeteilt. Die Käfige sind so aufzustellen, dass etwaige durch den Standort bedingte Aus-
wirkungen so gering wie möglich sind. Jedes Versuchstier sollte zur sicheren Identifizierung eine eigene Num-
mer erhalten.

1.4.2. Zubereitung der Dosen
Die Prüfsubstanz wird über eine Magensonde, mit der Nahrung oder dem Trinkwasser verabreicht. Die
Methode der oralen Verabreichung hängt von dem Zweck der Studie und den physikalischen/chemischen
Eigenschaften des Prüfmaterials ab.
Die Prüfsubstanz wird über eine Magensonde, mit der Nahrung oder dem Trinkwasser verabreicht. Die
Methode der oralen Verabreichung hängt von dem Zweck der Studie und den physikalischen/chemischen
Eigenschaften des Prüfmaterials ab.
1.4.3. Prüfbedingungen
1.4.3.1. Versuchstiere
Die bevorzugte Nagetierart ist die Ratte, doch können als Versuchstiere auch andere Nagetierarten, z. B. die
Maus, verwendet werden. Es sind junge, gesunde und ausgewachsene Tiere üblicher Laborstämme zu verwen-
den. Die weiblichen Tiere dürfen weder geworfen haben noch trächtig sein. Mit der Dosierung sollte möglichst
bald nach der Entwöhnung begonnen werden, auf jeden Fall jedoch, bevor die Tiere neun Wochen alt sind.
Bei Beginn der Studie sollten die Gewichtsunterschiede der Tiere möglichst gering sein und ± 20 % des
geschlechtsspezifischen Durchschnittsgewichts nicht überschreiten. Wenn die Studie als Vorstudie für eine
Langzeitstudie über chronische Toxizität durchgeführt wird, sollten in beiden Studien Tiere desselben Stamms
und derselben Herkunft verwendet werden.
1.4.3.2. Zahl und Geschlecht der Versuchstiere
Für jede Dosisstufe sind mindestens 20 Tiere (10 weibliche und 10 männliche) zu verwenden. Sollen im Ver-
lauf der Prüfung Tiere getötet werden, ist die Zahl der Tiere um die Zahl zu erhöhen, die bereits vor Abschluss
der Studie getötet werden sollen. Aufgrund bereits bekannter Wirkungen des chemischen Stoffs oder eines eng
verwandten Analogons sollte darüber hinaus für die Kontrollgruppe und die Gruppe mit der höchsten Dosis
die Aufnahme einer Satellitengruppe von zehn Tieren (fünf jeden Geschlechts) zwecks Behandlung und
anschließender Beobachtung der Reversibilität oder Persistenz etwaiger toxischer Wirkungen erwogen werden.
Die Dauer dieses Zeitraums nach der Behandlung sollte den beobachteten Wirkungen angemessen sein.
1.4.3.3. Dosierung
Es sollten mindestens drei Dosierungen und eine gleichzeitige Kontrolle verwendet werden, es sei denn, ein
Limit-Test wird durchgeführt (siehe 1.4.3.4). Die Dosierungen können auf der Grundlage der Ergebnisse von
Studien mit wiederholter Verabreichung oder Studien zur Ermittlung des Dosisbereichs festgelegt werden und
sollten sämtliche für die Prüfsubstanz oder verwandte Materialien verfügbaren toxikologischen und toxikokine-
tischen Daten berücksichtigen. Außer wenn dies wegen der physikalisch-chemischen Eigenschaften oder der
biologischen Wirkungen der Prüfsubstanz unmöglich ist, sollte die höchste Dosierung gewählt werden, um
Toxizität, jedoch nicht Tod oder schweres Leiden der Tiere zu induzieren. Zum Nachweis dosisabhängiger
Reaktionen und einer NOAEL bei niedrigster Dosierung, sollten die Dosierungen in absteigender Folge ver-
abreicht werden. Zwei- bis vierfache Abstände haben sich oft als optimale Dosisabstufungen erwiesen, auch ist
meist eine vierte Testgruppe der Anwendung sehr großer Dosisabstände (z. B. mehr als ein Faktor von ca.
6-10) vorzuziehen.
Die Kontrollgruppe sollte eine unbehandelte Gruppe oder eine Vehikel-Kontrollgruppe sein, sofern ein Vehikel
zur Verabreichung der Prüfsubstanz verwendet wird. Abgesehen von der Behandlung mit der Prüfsubstanz
sollten die Tiere der Kontrollgruppe identisch mit denen der Testgruppen behandelt werden. Wird ein Vehikel
verwendet, erhält die Kontrollgruppe das Vehikel im höchsten verwendeten Volumen. Wird eine Prüfsubstanz
mit dem Futter verabreicht, und führt dies zu einer verminderten Futteraufnahme, kann eine paarweise gefüt-
terte Kontrollgruppe nützlich sein, wobei zwischen einer verminderten Futteraufnahme aus geschmacklichen
Gründen oder wegen toxikologischer Veränderungen im Prüfmodell unterschieden wird.
Zu berücksichtigen sind gegebenenfalls folgende Merkmale des Vehikel und anderer Additive: Wirkungen auf
die Absorption, die Verteilung, den Stoffwechsel oder die Retention der Prüfsubstanz; Wirkungen auf die che-
mischen Eigenschaften der Prüfsubstanz, die zur Änderung von führen toxischen Eigenschaften können kann;
ferner Wirkungen auf die Futter- oder Wasseraufnahme oder den Ernährungszustand der Versuchstiere.
1.4.3.4. Limit test
Ergibt eine Prüfung bei einer einzigen Dosis von mindestens 1 000 mg/kg Körpergewicht/Tag unter Anwen-
dung der für diese Studie beschriebenen Verfahren keine adversen Effekte und ist aufgrund der Daten struktur-
verwandter Stoffe keine Toxizität zu erwarten, kann auf eine vollständige Studie mit drei Dosisstufen gegebe-
nenfalls verzichtet werden. Der Limit-Test ist anzuwenden, außer wenn die Expositionswirkungen beim Men-
schen die Prüfung bei einer höheren Dosis erforderlich erscheinen lässt.

1.5. VERSUCHSDURCHFÜHRUNG
1.5.1. Verabreichung der Dosen
Die Versuchstiere erhalten die Prüfsubstanz an sieben Tagen der Woche über einen Zeitraum von 90 Tagen.
Jede Abweichung von diesem Dosierungsplan, z. B. fünf Tage je Woche, ist zu begründen. Wird die Prüfsub-
stanz über eine Sonde verabreicht, so sollte dies in einer einmaligen Dosis unter Verwendung einer Magen-
sonde oder einer geeigneten Intubationskanüle erfolgen. Das maximale Flüssigkeitsvolumen, das einem Ver-
suchstier mit einer Gabe verabreicht werden kann, hängt von der Größe des Versuchstiers ab. Das Volumen
sollte 1 ml/100g Körpergewicht nicht überschreiten, außer bei wässrigen Lösungen, von denen 2 ml/100g
Körpergewicht gegeben werden können. Außer für Reizungen auslösende oder ätzende Stoffe, die in der Regel
bei höheren Konzentrationen eine Verschlimmerung bewirken, sollte die Variabilität des Prüfvolumens durch
Anpassung der Konzentration möglichst gering gehalten werden, um ein konstantes Volumen bei allen Dosen
zu gewährleisten.
Für mit dem Futter oder dem Trinkwasser verabreichte Stoffe ist unbedingt sicherzustellen, dass die Mengen
der jeweiligen Prüfsubstanz die normale Nahrungsaufnahme oder den Wasserhaushalt nicht beeinträchtigen.
Wenn die Prüfsubstanz mit dem Futter verabreicht wird, können entweder eine konstante Futterkonzentration
(ppm) oder eine konstante Dosierung in Relation zum Körpergewicht des Versuchstiers verwendet werden. Die
angewandte Alternative ist zu spezifizieren. Eine mit einer Magensonde verabreichte Dosis sollte jeweils zu
denselben Tageszeiten gegeben und so angepasst werden, dass eine konstante Dosis in Relation zum Körper-
gewicht aufrechterhalten wird. Wird eine 90-Tage-Studie als Vorstudie für eine Langzeitstudie über chronische
Toxizität verwendet, sollte in beiden Studien die gleiche Nahrung gegeben werden.
1.5.2. Beobachtungen
Der Beobachtungszeitraum sollte mindestens 90 Tage betragen. Tiere einer Satellitengruppe, die für Nachfolge-
beobachtungen vorgesehen sind, sollten für einen angemessenen Zeitraum ohne Behandlung bleiben, um fest-
zustellen, ob die toxischen Wirkungen fortbestehen oder sich als reversibel erweisen.
Allgemeine klinische Beobachtungen sollten mindestens einmal täglich, vorzugsweise zur selben Tageszeit,
unter Berücksichtigung des Zeitraums, in dem der Wirkungsgipfel nach Verabreichung der Dosis zu erwarten
ist, vorgenommen werden. Der klinische Zustand der Tiere ist zu dokumentieren. Alle Tiere sind mindestens
zweimal täglich, in der Regel morgens und abends, auf Anzeichen von Morbidität und Mortalität hin zu unter-
suchen.
Mindestens einmal vor der ersten Exposition (für intraindividuelle Vergleiche) und danach einmal pro Woche
sollten bei allen Tieren eingehende klinische Beobachtungen vorgenommen werden. Diese Beobachtungen soll-
ten außerhalb des Käfigs erfolgen, in dem die Tiere gehalten werden, und zwar vorzugsweise in einem Stan-
dardgehege jeweils zu denselben Zeiten. Sie sind sorgfältig zu dokumentieren, am besten nach einer speziell
vom Prüflabor entwickelten Bewertungsskala. Es ist dafür zu sorgen, dass die Beobachtungsbedingungen mög-
lichst konstant bleiben. Die Beobachtungen sollten sich insbesondere beziehen auf Veränderungen an Haut,
Fell, Augen, Schleimhäuten, auf Sekrete und Exkrete sowie auf autonome Reaktionen (z. B. Tränenfluss, Piloe-
rektion, Pupillengröße, anormale Atmung). Gang-, und Haltungsstörungen, ferner Reaktionen auf den Umgang
mit den Tieren sowie etwaige klonische oder tonische Bewegungen, Stereotypien (z. B. übermäßiges Putzen,
wiederholte Kreisbewegungen) oder abnormes Verhalten (z. B. Selbstverstümmelung, Rückwärtsgehen) sollten
auch dokumentiert werden (1).
Ophthalmologische Untersuchungen unter Verwendung eines Ophthalmoskops oder eines entsprechenden
geeigneten Geräts sollten vorgenommen werden, bevor die Prüfsubstanz verabreicht wird, sowie zum
Abschluss der Studie, vorzugsweise an allen Tieren, doch zumindest in den höchstdosierten Gruppen und den
Kontrollgruppen. Sofern Veränderungen an den Augen beobachtet werden, sollten alle Tiere untersucht wer-
den.
Zum Ende des Expositionszeitraums, jedenfalls nicht früher als in der 11. Woche, sollten sensorische Reaktio-
nen auf Reize verschiedener Art (1) (z. B. akustische, visuelle und propriozeptive Reize) (2), (3), (4), sowie die
Greifstärke (5) und die motorische Aktivität (6) erfasst werden. Weitere Einzelheiten zu den möglichen Unter-
suchungen finden sich in der Literatur. Allerdings können auch andere als dort genannte Verfahren angewen-
det werden.
Funktionelle Beobachtungen zum Abschluss der Studie können entfallen, wenn Daten über funktionelle Beob-
achtungen aus anderen Studien vorliegen und die täglichen klinischen Beobachtungen keine Funktionsdefizite
aufweisen.
In Ausnahmefällen können funktionelle Beobachtungen auch bei Gruppen entfallen, die so starke sonstige
Toxizitätsanzeichen aufweisen, dass die Leistungen in Funktionstests dadurch signifikant beinträchtigt würden.

1.5.2.1. Körpergewicht und Futter-/Wasseraufnahme
Alle Tiere sollten mindestens einmal wöchentlich gewogen werden. Messungen der Futteraufnahme sollten
mindestens wöchentlich vorgenommen werden. Wenn die Prüfsubstanz über das Trinkwasser verabreicht wird,
sollte auch die Wasseraufnahme mindestens einmal wöchentlich gemessen werden. Die Wasseraufnahme kann
auch in Fütterungsstudien oder in Studien mit Sondenapplikation berücksichtigt werden, bei denen sich das
Trinkverhalten ändern kann.
1.5.2.2. Hämatologische und klinisch-biochemische Untersuchungen
Die Blutproben sind an einer zu benennenden Stelle zu entnehmen und möglichst unter geeigneten Bedingun-
gen zu lagern. Am Ende des Prüfzeitraums werden bei den Versuchstieren Blutproben kurz vor der Tötung
oder als Teil des Tötungsvorgangs entnommen.
Folgende hämatologische Untersuchungen sind am Ende des Prüfzeitraums und bei etwaigen zwischenzeitlich
entnommenen Blutproben durchzuführen: Hämatokritwert, Hämoglobinkonzentration, Erythrozytenzahl, Leu-
kozytenzahl (Gesamt- und Differentialblutbild), Thrombozytenzahl und Messung der Blutgerinnungszeit/Blut-
gerinnungsfähigkeit.
Klinisch-biochemische Bestimmungen zur Untersuchung der wichtigsten toxischen Wirkungen in Geweben,
insbesondere der Wirkungen auf Nieren und Leber, sind an Blutproben erfolgen, die von jedem Tier unmittel-
bar vor der Tötung oder als Teil des Tötungsvorgangs entnommen werden (dies gilt nicht für Tiere, die ster-
bend aufgefunden und/oder zwischenzeitlich getötet werden). Vergleichbar zu den hämatologischen Unter-
suchungen können klinisch-biochemische Untersuchungen bei den zwischenzeitlich entnommenen Blutproben
durchgeführt werden. Es empfiehlt sich eine Futterkarenz der Tiere über Nacht, bevor die Blutproben entnom-
men werden ( 1 ). Die Plasma- oder Serumbestimmungen umfassen die Parameter Natrium, Kalium, Glukose,
Gesamtcholesterin, Harnstoff, Harnstoff-Stickstoff im Blut, Kreatinin, Gesamtprotein und Albumin sowie mehr
als zwei Enzyme, die auf hepatozelluläre Wirkungen (wie Alanin-Aminotransferase, Aspartat-Aminotransferase,
alkalische Phosphatase, Gammaglutamyl-Transpeptidase und Sorbitoldehydrogenase) schließen lassen. Ferner
kann die Bestimmung weiterer Enzyme (der Leber oder sonstiger Organe) und der Gallensäuren, die unter
bestimmten Bedingungen ebenfalls nützliche Informationen liefern, durchgeführt werden.
Zusätzlich (Optional?) können in der letzten Woche der Studie am Urin, der zu festgelegten Zeiten gesammelt
wird, folgende Analysebestimmungen durchgeführt werden: Aussehen, Volumen, Osmolalität oder spezifisches
Gewicht, pH-Wert, Eiweiß, Glukose und Blut/Blutzellen.
Darüber hinaus sollten Untersuchungen zur Bestimmung von Serummarkern für eine allgemeine Gewebsschä-
digung erwogen werden. Des Weiteren sollten, wenn die bekannten Eigenschaften der Prüfsubstanz die ent-
sprechenden Stoffwechselprofile beeinträchtigen können oder wenn mit einer solchen Beeinträchtigung zu
rechnen ist, die Parameter Calcium, Phosphor, Nüchtern-triglyzeride, spezifische Hormone, Methämoglobin
und Cholinesterase bestimmt werden. Die jeweiligen Parameter sind je nach Prüfsubstanzklasse bzw. von Fall
zu Fall zu bestimmen.
Insgesamt jedoch ist je nach der Versuchstierart und den beobachteten und/oder erwarteten Wirkungen der
Prüfsubstanz mit der entsprechenden Flexibilität vorzugehen.
Bei unzureichender Datenlage zu den Normalwerten, sollte die Bestimmung hämatologischer und klinisch-bio-
chemischer Parameter gegebenenfalls auch vor Verabreichung der Prüfsubstanz erwogen werden. In der Regel
empfiehlt es sich nicht, diese Daten vor der Behandlung zu bestimmen (7).

1.5.2.3. Autopsie
Alle an der Studie beteiligten Tiere müssen einer vollständigen, eingehenden Autopsie unterzogen werden, die
die sorgfältige Untersuchung der äußeren Körperoberfläche, aller Körperöffnungen sowie der Schädel-, Brust-
und Bauchhöhlen und ihres Inhalts umfasst. Leber, Nieren, Nebennieren, Hoden, Nebenhoden, Uterus, Eierstö-
cke, Thymus, Milz, Gehirn und Herz aller Tiere (außer der tot aufgefundenen und/oder zwischenzeitlich getö-
ten Tiere) sind in angemessener Form von anhaftendem Gewebe zu befreien, und ihr Nassgewicht ist so rasch
wir möglich nach der Sektion festzustellen, um ein Austrocknen zu verhindern.

Die folgenden Gewebe sind in dem für Gewebsarten und die vorgesehene nachfolgende histopathologische
Untersuchung am besten geeigneten Fixierungsmedium aufzubewahren: alle Gewebe mit makroskopischen
Läsionen, Gehirn (repräsentative Bereiche, insbesondere Cerebrum, Cerebellum und Medulla/Pons), Rücken-
mark (auf drei Ebenen: cervical, mittlerer Thoraxbereich, und lumbar), Hypophyse, Schilddrüse, Nebenschild-
drüse, Thymusdrüse, Speiseröhre, Speicheldrüsen, Magen, Dünn- und Dickdarm (einschließlich Peyer'schen
Platten), Leber, Bauchspeicheldrüse, Nieren, Nebennieren, Milz, Herz, Luftröhre und Lungen (durch Inflation
mit Fixiermittel und anschließende Immersion konserviert), Aorta, Gonaden, Uterus akzessorische Geschlechts-
organe, weibliche Brustdrüsen, Prostata, Harnblase, Gallenblase (Maus), Lymphknoten (vorzugsweise ein
Lymphknoten des Verabreichungsweges und ein weiterer vom Verabreichungsweg entfernter Lymphknoten,
um systemische Wirkungen abzudecken), periphere Nerven (N. ischiadicus oder N. tibialis), vorzugsweise in
der Nähe des Muskels, ein Knochenmarksschnitt (und/oder ein frisches Knochenmark-Aspirat) Haut und Augen
(sofern bei den ophthalmologischen Untersuchungen Veränderungen beobachtet wurden). Die klinischen und
sonstigen Befunde können weitere Gewebsuntersuchungen erforderlich machen. Auch Organe, die aufgrund
der bekannten Eigenschaften der Prüfsubstanz als wahrscheinliche Zielorgane in Frage kommen, sollten auf-
bewahrt werden.
1.5.2.4. Histopathologische Untersuchungen
Bei allen Tieren der Gruppe mit der höchsten Dosis sowie bei den Tieren der Kontrollgruppe ist eine umfas-
sende histopathologische Untersuchung der konservierten Organe und Gewebe durchzuführen. Diese Unter-
suchungen sind auch auf die Tiere aller anderen Dosisgruppen auszudehnen, wenn behandlungsbedingte Ver-
änderungen in der Gruppe mit der höchsten Dosis festgestellt werden.
Alle makroskopischen Läsionen sind zu untersuchen.
Umfaßt eine Prüfung auch eine Satellitengruppe, sind bei den Tieren dieser Gruppe die Gewebe und Organe
histopathologisch zu untersuchen, bei denen in den Behandlungsgruppen toxische Wirkungen aufgetreten
sind.
2. DATEN UND BERICHTERSTATTUNG
2.1. DATEN
Es sollten Daten für jedes einzelne Tier vorgelegt werden. Außerdem sollten alle Daten in Tabellenform zusam-
mengefasst werden, aus denen für jede Prüfgruppe folgende Angaben hervorgehen: die Zahl der Tiere bei
Beginn der Prüfung und die Zahl der während der Prüfung tot aufgefundenen oder aus Gründen des Tierschut-
zes getöteten Tiere, ferner der Zeitpunkt des eingetretenen Todes oder der aus Tierschutzgründen vorgenom-
menen Tötung, die Zahl der Tiere, die Anzeichen von Toxizität aufweisen, eine Beschreibung der beobachteten
Toxizität, einschließlich des Zeitpunkts, zu dem die toxischen Wirkungen erstmalig aufgetreten sind, deren
Dauer und Schweregrad, die Zahl der Tiere mit Läsionen, die Art der Läsionen und der Prozentsatz der davon
betroffenen Tiere.
Wenn möglich sind die numerischen Daten durch eine geeignete allgemein annehmbare statistische Methode
auszuwerten. Die statistischen Methoden und die zu analysierenden Daten sollten bei der Planung der Studie
festgelegt werden.
2.2. PRÜFBERICHT
Der Prüfbericht muß folgende Angaben enthalten:
2.2.1. Prüfsubstanz:
Š physikalische Beschaffenheit, Reinheit und physikalisch-chemische Eigenschaften;
Š Identifizierungsdaten;
Š Vehikel (sofern zutreffend): Begründung der Wahl des Vehikel, sofern anders als Wasser.
2.2.2. Versuchstierart:
Š Tierart und Stamm;
Š Zahl, Alter und Geschlecht der Tiere;

Š Herkunft, Haltungsbedingungen, Futter usw.;
Š individuelles Gewicht der Tiere zu Beginn der Prüfung.
2.2.3. Prüfbedingungen:
Š Begründung der Wahl der Dosisstufen;
Š Einzelheiten der Formulierung der Prüfsubstanz/Futterzubereitung, erzielte Konzentration, Stabilität und
Homogenität der Zubereitung;
Š Angaben zur Verabreichung der Prüfsubstanz;
Š tatsächliche Dosen (mg/kg Körpergewicht/Tag) und, sofern zutreffend, Angaben zur Umrechnung der
Konzentration der Prüfsubstanz im Futter/Trinkwasser (ppm) in die tatsächliche Dosis;
Š Einzelheiten der Futter- und Wasserqualität.
2.2.4. Ergebnisse:
Š Körpergewicht und Änderungen des Körpergewichts;
Š gegebenenfalls Angaben zur Futter- und Wasseraufnahme;
Š Daten der toxischen Wirkung nach Geschlecht und Dosis, einschließlich Toxizitätsanzeichen;
Š Art, Schweregrad und Dauer der klinischen Beobachtungen (mit Angaben zur Reversibilität);
Š Ergebnisse aus der ophthalmologische Untersuchung;
Š Bewertung der Sensorik, Greifstärke und motorische Aktivität (sofern zutreffend);
Š hämatologische Tests mit entsprechenden Normalwerten;
Š klinisch- biochemische Tests mit entsprechenden Normalwerten;
Š terminales Körpergewicht, Organgewichte und Verhältnis Organ-/Körpergewicht;
Š Sektionsbefunde;
Š ausführliche Beschreibung aller histopathologischen Befunde;
Š statistische Auswertung der Ergebnisse, wenn möglich.
Diskussion der Ergebnisse.
Schlussfolgerungen.

3. LITERATUR
(1) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to
Chemicals. Environmental Health Criteria Document No 60.
(2) Tupper, D. E., Wallace, R.B. (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp.,
40, pp. 999-1003.
(3) Gad, S. C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol. Environ. Health,
9, pp. 691-704.
(4) Moser, V. C., Mc Daniel, K. M., Phillips, P. M. (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a
Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol.,
108, pp. 267-283.
(5) Meyer O. A., Tilson H. A., Byrd W. C., Riley M. T. (1979). A Method for the Routine Assesment of Fore-
and Hind- limb grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxivol., 1, pp. 233-236.
(6) Crofton K. M., Howard J. L., Moser V. C., Gill M. W., Reiter L. W., Tilson H. A., MacPhail R. C. (1991).
Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological
Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13, pp. 599-609.
(7) Weingand K., Brown G., Hall R. et al (1996). ‚Harmonisation of Animal Clinic Pathology Testing in
Toxicity and Safety Studies™, Fundam. & Appl. Toxicol., 29, pp. 198-201.

ANHANG 5E
B.27. PRÜFUNG AUF SUB-CHRONISCHE ORALE TOXIZITÄT
90-TAGE-TOXIZITÄSTUDIE BEI WIEDERHOLTER ORALER VERABREICHUNG AN NICHT-NAGETIEREN
1. METHODE
Diese Methode zur Prüfung auf subchronische orale Toxizität entspricht der OECD TG 409 (1998).
1.1. EINLEITUNG
Bei der Beurteilung und Bewertung der toxischen Merkmale eines chemischen Stoffs kann die Bestimmung
der subchronischen Toxizität bei wiederholter oraler Verabreichung von Wirkstoffgaben durchgeführt wer-
den, nachdem erste Toxizitätsdaten anhand von Prüfungen auf akute Toxizität oder 28-Tage-Tests auf Toxi-
zität bei wiederholter Verabreichung erzielt wurden. Die 90-Tage-Studie liefert Informationen über mögliche
gesundheitliche Schädigungen, die durch wiederholte Exposition über einen Zeitraum des schnellen Wachs-
tums bis zum frühen Stadium des Erwachsenseins entstehen können. Die Studie liefert ferner Informationen
über die wichtigsten toxischen Wirkungen, zeigt die Zielorgane und eine mögliche Akkumulation auf und
kann zur Ableitung einer NOAEL (NOAEL Š Dosis ohne beobachtete schädigende Wirkung) beitragen, die
zur Wahl der Dosierungen für Untersuchungen der chronischen Toxizität und zur Festlegung von Sicher-
heitskriterien für die Humanexposition herangezogen werden kann.
Die Prüfmethode soll dazu beitragen, die schädigenden Wirkungen einer Exposition gegenüber Chemikalien
bei Nicht-Nagetieren festzustellen und sollte nur in folgenden Fällen angewandt werden:
Š wenn in anderen Studien beobachtete Wirkungen eine Klärung/Charakterisierung an einer zweiten Tier-
art, den Nicht-Nagetieren, erforderlich machen;
Š wenn toxikokinetische Studien darauf hindeuten, dass die Verwendung einer spezifischen Art von
Nicht-Nagetieren die relevanteste Wahl von Versuchstieren ist, oder
Š wenn andere spezifische Gründe die Verwendung einer Nicht-Nagetierart rechtfertigen.
Siehe auch Allgemeine Einleitung Teil B.
1.2. BEGRIFFSBESTIMMUNGEN
Dose ist die Menge der verabreichten Prüfsubstanz. Die Dosis wird als Gewicht (g, mg) oder als Gewicht
der Prüfsubstanz je Gewichtseinheit des Versuchstiers (z. B. mg/kg) oder als konstante Futterkonzentration
(ppm) ausgedrückt.
Dosierung ist ein allgemeiner Begriff, der die Dosis, ihre Häufigkeit und die Dauer der Verabreichung
umfasst.
NOAEL ist die Abkürzung für no-observed adverse effect level und entspricht der höchsten Dosis, bei der keine
schädigenden behandlungsbedingten Wirkungen festgestellt werden.
1.3. PRINZIP DER METHODE
Die Prüfsubstanz wird täglich über einen Zeitraum von 90 Tagen in abgestuften Dosen an mehrere Grup-
pen von Versuchstieren verabreicht, und zwar eine Dosisstufe je Gruppe. Während des Verabreichungszeit-
raums werden die Tiere sorgfältig auf Toxizitätsanzeichen beobachtet. Während der Prüfung verendete oder
getötete Tiere werden seziert. Am Ende der Prüfung werden alle noch lebenden Tiere getötet und ebenfalls
seziert.
1.4. BESCHREIBUNG DER METHODE
1.4.1. Auswahl von Versuchstierarten
Die am häufigsten verwendete Nicht-Nagetierart ist der Hund, der einer bestimmten Rasse angehören sollte.
Häufig wird der Beagle verwendet. Ferner können Tierarten wie Schwein oder Minischwein verwendet wer-
den. Primaten werden nicht empfohlen, und ihre Verwendung ist zu begründen. Es sollten junge und
gesunde Tiere verwendet werden. Bei Hunden sollte mit der Dosierung vorzugsweise im Alter von vier bis

sechs Monaten, jedoch nicht später als neun Monaten begonnen werden. Wird die Studie als Vorstudie für
eine Langzeitstudie über chronische Toxizität durchgeführt, sollten in beiden Studien dieselbe Art/Rasse ver-
wendet werden.
1.4.2. Vorbereitung der Tiere
Zu verwenden sind gesunde Jungtiere, die an die Laborbedingungen gewöhnt und bisher nicht für Tierver-
suche verwendet wurden. Die Dauer der Gewöhnung hängt von der für die Prüfung gewählten Art und der
Herkunft der Tiere ab. Empfohlen werden mindestens fünf Tage für Hunde oder für speziell zu diesem
Zweck gezüchtete Schweine aus einer internen Kolonie und mindestens zwei Wochen für Tiere externer
Herkunft. Von den Versuchstieren sollten Art, Stamm, Herkunft, Geschlecht, Gewicht und/oder Alter fest-
gestellt werden. Die Tiere werden nach dem Zufallsprinzip in Kontroll- und Behandlungsgruppen eingeteilt.
Die Käfige sind so aufzustellen, dass etwaige durch den Standort bedingte Auswirkungen möglichst gering
sind. Jedes Versuchstier sollte zur sicheren Identifizierung eine eigene Nummer erhalten.
1.4.3. Zubereitung der Dosen
Die Prüfsubstanz wird mit dem Futter oder im Trinkwasser über eine Magensonde oder in Kapseln ver-
abreicht. Die Methode der oralen Verabreichung hängt von dem Zweck der Studie und den physikalisch-
chemischen Eigenschaften des Prüfmaterials ab.
Bei Bedarf wird die Prüfsubstanz in einem geeigneten Medium gelöst oder suspendiert. Es empfiehlt sich,
nach Möglichkeit zunächst die Verwendung einer wässrigen Lösung/Suspenion, sodann eine Lösung/Emul-
sion in Öl (z. B. Maisöl) und erst dann eine Lösung in anderen Medien in Betracht zu ziehen. Bei anderen
Medien als Wasser müssen seine toxischen Merkmale bekannt sein. Die Stabilität der Prüfsubstanz unter den
Verabreichungsbedingungen ist festzustellen.
1.5. VERSUCHSDURCHFÜHRUNG
1.5.1. Zahl und Geschlecht der Versuchstiere
Für jede Dosisstufe sind mindestens acht Tiere (vier weibliche und vier männliche) zu verwenden. Sollten
im Verlauf der Prüfung Tiere getötet werden, ist die Zahl der Tiere um die Zahl zu erhöhen, die bereits vor
Abschluss der Studie getötet werden sollen. Die Zahl der Tiere bei Beendigung der Studie muss für eine
sinnvolle Bewertung der toxischen Wirkungen angemessen sein. Aufgrund bereits bekannter Wirkungen der
Substanz oder eines eng verwandten Analogons sollte darüber hinaus für die Kontrollgruppe und die
Gruppe mit der höchsten Dosis die Aufnahme einer Satellitengruppe von acht Tieren (vier jeden
Geschlechts) zwecks Behandlung und anschließender Beobachtung der Reversibilität oder Persistenz etwaiger
toxischer Wirkungen erwogen werden. Die Dauer dieses Zeitraums nach der Behandlung sollten den beob-
achteten Wirkungen angemessen sein.
1.5.2. Dosierung
Es sollten mindestens drei Dosierungen und eine gleichzeitige Kontrolle verwendet werden, es sei denn, ein
Limit-Test wird durchgeführt (siehe 1.4.3.4). Die Dosierungen können auf der Grundlage der Ergebnisse von
Studien mit wiederholter Verabreichung oder Studien zur Ermittlung des Dosisbereichs festgelegt werden
und sollten sämtliche für die Prüfsubstanz oder verwandte Materialien verfügbaren toxikologischen und toxi-
kokinetischen Daten berücksichtigen. Außer wenn dies wegen der physikalisch-chemischen Eigenschaften
oder der biologischen Wirkungen der Prüfsubstanz unmöglich ist, sollte die höchste Dosierung gewählt wer-
den, um Toxizität, jedoch nicht Tod oder schweres Leiden der Tiere zu induzieren. Zum Nachweis dosis-
abhängiger Reaktionen und einer NOAEL bei niedrigster Dosierung, sollten die Dosierungen in absteigender
Folge verabreicht werden. Zwei- bis vierfache Abstände haben sich oft als optimale Dosisabstufungen erwie-
sen, auch ist meist eine vierte Testgruppe der Anwendung sehr großer Dosisabstände (z. B. mehr als ein
Faktor von ca. 6-10) vorzuziehen.
Die Kontrollgruppe sollte eine unbehandelte Gruppe oder eine Vehikel-Kontrollgruppe sein, sofern ein Vehi-
kel zur Verabreichung der Prüfsubstanz verwendet wird. Abgesehen von der Behandlung mit der Prüfsub-
stanz sollten die Tiere der Kontrollgruppe identisch mit denen der Testgruppen behandelt werden. Wird ein
Vehikel verwendet, erhält die Kontrollgruppe das Vehikel im höchsten verwendeten Volumen. Wird eine
Prüfsubstanz mit dem Futter verabreicht, und führt dies zu einer verminderten Futteraufnahme, kann eine
paarweise gefütterte Kontrollgruppe nützlich sein, wobei zwischen einer verminderten Futteraufnahme aus
geschmacklichen Gründen oder wegen toxikologischer Veränderungen im Prüfmodell unterschieden wird.

Zu berücksichtigen sind gegebenenfalls folgende Merkmale des Vehikel und anderer Additive: Wirkungen
auf die Absorption, die Verteilung, den Stoffwechsel oder die Retention der Prüfsubstanz; Wirkungen auf
die chemischen Eigenschaften der Prüfsubstanz, die zur Änderung von toxischen Eigenschaften führen kön-
nen kann; ferner Wirkungen auf die Futter- oder Wasseraufnahme oder den Ernährungszustand der Ver-
suchstiere.
1.5.3. Limit-Test
Ergibt eine Prüfung bei einer einzigen Dosis von mindestens 1 000 mg/kg Körpergewicht/Tag unter Anwen-
dung der für diese Studie beschriebenen Verfahren keine adversen Effekte und ist aufgrund der Daten struk-
turverwandter Stoffe keine Toxizität zu erwarten, kann auf eine vollständige Studie mit drei Dosisstufen
gegebenenfalls verzichtet werden. Der Limit-Test ist anzuwenden, außer wenn die Expositionswirkungen
beim Menschen die Prüfung bei einer höheren Dosis erforderlich erscheinen lässt.
1.5.4. Verabreichung der Dosen
Die Versuchstiere erhalten die Prüfsubstanz an sieben Tagen der Woche über einen Zeitraum von 90 Tagen.
Jede Abweichung von diesem Dosierungsplan, z. B. fünf Tage je Woche, ist zu begründen. Wird die Prüf-
substanz über eine Sonde verabreicht, so sollte dies in einer einmaligen Dosis unter Verwendung einer
Magensonde oder einer geeigneten Intubationskanüle erfolgen. Das maximale Flüssigkeitsvolumen, das
einem Versuchstier mit einer Gabe verabreicht werden kann, hängt von der Größe des Versuchstiers ab.
Generell sollte das Volumen möglichst gering sein. Außer für Reizungen auslösende oder ätzende Stoffe, die
in der Regel bei höheren Konzentrationen eine Verschlimmerung bewirken, sollte die Variabilität des Prüfvo-
lumens durch Anpassung der Konzentration möglichst gering gehalten werden, um ein konstantes Volumen
bei allen Dosen zu gewährleisten.
Für mit dem Futter oder dem Trinkwasser verabreichte Stoffe ist unbedingt sicherzustellen, dass die Mengen
der jeweiligen Prüfsubstanz die normale Nahrungsaufnahme oder den Wasserhaushalt nicht beeinträchtigen.
Wenn die Prüfsubstanz mit dem Futter verabreicht wird, können entweder eine konstante Futterkonzentra-
tion (ppm) oder eine konstante Dosierung in Relation zum Körpergewicht verwendet werden. Jede ange-
wandte Alternative ist zu spezifizieren. Eine mit einer Magensonde oder in Kapseln verabreichte Substanz
sollte jeweils zu denselben Tageszeiten gegeben und so angepasst werden, dass eine konstante Dosis in Rela-
tion zum Körpergewicht aufrechterhalten bleibt. Wird eine 90-Tage-Studie als Vorstudie für eine Langzeit-
studie über chronische Toxizität verwendet, sollte in beiden Studien die gleiche Nahrung verabreicht wer-
den.
1.5.5. Beobachtungen
Der Beobachtungszeitraum sollte mindestens 90 Tage betragen. Tiere einer Satellitengruppe, die für Nachfol-
gebeobachtungen vorgesehen sind, sollten für einen angemessenen Zeitraum ohne Behandlung bleiben, um
festzustellen, ob die toxischen Wirkungen fortbestehen oder sich als reversibel erweisen.
Allgemeine klinische Beobachtungen sollten mindestens einmal täglich, vorzugsweise zur selben Tageszeit,
unter Berücksichtigung des Zeitraums, in dem der Wirkungsgipfel nach Verabreichung der Dosis zu erwar-
ten ist, vorgenommen werden. Der klinische Zustand der Tiere ist zu dokumentieren. Alle Tiere sind min-
destens zweimal täglich, in der Regel morgens und abends, auf Anzeichen von Morbidität und Mortalität
hin zu untersuchen.
Mindestens einmal vor der ersten Exposition (für intraindividuelle Vergleiche) und danach einmal pro
Woche sollten bei allen Tieren umfassende klinische Beobachtungen vorgenommen werden. Diese Beobach-
tungen sollten, sofern praktisch durchführbar, außerhalb des Käfigs erfolgen, in dem die Tiere gehalten wer-
den, und zwar vorzugsweise in einem Standardgehege jeweils zu denselben Zeiten. Die Beobachtungsbedin-
gungen sollten möglichst konstant sein. Anzeichen von Toxizität sind sorgfältig zu dokumentieren, ins-
besondere Beginn, Schweregrad und Dauer. Die Beobachtungen sollten sich insbesondere beziehen auf Ver-
änderungen an Haut, Fell, Augen, Schleimhäuten, auf Sekrete und Exkrete sowie auf autonome Reaktionen
(z. B. Tränenfluß, Piloerektion, Pupillengröße, anormale Atmung). Gang- und Haltungsstörungen, ferner
Reaktionen auf den Umgang mit den Tieren sowie etwaige klonische oder tonische Bewegungen, Stereo-
typien (z. B. übermäßiges Putzen, wiederholte Kreisbewegungen) oder abnormes Verhalten (z. B. Selbstver-
stümmelung, Rückwärtsgehen) sollten auch dokumentiert werden.
Ophthalmologische Untersuchungen unter Verwendung eines Ophthalmoskops oder eines entsprechenden
geeigneten Geräts sollten vorgenommen werden, bevor die Prüfsubstanz verabreicht wird, sowie zum
Abschluss der Studie, vorzugsweise an allen Tieren, zumindest jedoch in den höchstdosierten Gruppen und
den Kontrollgruppen. Sofern behandlungsbedingte Veränderungen an den Augen beobachtet werden, sollten
alle Tiere untersucht werden.

1.5.5.1. Körpergewicht und Futter-/Wasseraufnahme
Alle Tiere sollten mindestens einmal wöchentlich gewogen werden. Messungen der Futteraufnahme sollten
mindestens wöchentlich vorgenommen werden. Wenn die Prüfsubstanz über das Trinkwasser verabreicht
wird, sollte auch die Wasseraufnahme mindestens einmal wöchentlich gemessen werden. Die Wasserauf-
nahme kann auch in Fütterungsstudien oder in Studien mit Sondenapplikation berücksichtigt werden, bei
denen sich das Trinkverhalten ändern kann.
1.5.5.2. Hämatologische und und klinisch-biochemische Untersuchungen
Die Blutproben sind an einer zu benennenden Stelle zu entnehmen und möglichst unter geeigneten Bedin-
gungen zu lagern. Am Ende des Prüfzeitraums werden bei den Versuchstieren Blutproben kurz vor der
Tötung oder als Teil des Tötungsvorgangs entnommen.
Hämatologische Untersuchungen sind zu Beginn der Studie und anschließend entweder monatlich oder zur
Halbzeit und schließlich am Ende des Prüfzeitraums vorzunehmen: Hämatokritwert, Hämoglobinkonzentra-
tion, Erythrozytenzahl, Leukozytenzahl (Gesamt- und Differentialblutbild), Thrombozytenzahl und Bestim-
mung des Gerinnungspotentials, wie Gerinnungszeit, Prothrombinzeit oder Thromboplastinzeit.
Klinisch-biochemische Bestimmungen zur Untersuchung der wichtigsten toxischen Wirkungen in Geweben,
insbesondere der Wirkungen auf Nieren und Leber, sind an Blutproben durchzuführen, die von jedem Tier
zu Beginn und anschließend entweder monatlich oder zur Halbzeit und schließlich am Ende des Prüfzeit-
raums entnommen werden. Die Prüfungen sollten folgende Bereiche abdecken: Elektrolythaushalt, Kohlehy-
dratstoffwechsel sowie Leber- und Nierenfunktion. Die Wahl der spezifischen Prüfungen hängt von den
Beobachtungen über die Wirkungsweise der Prüfsubstanz ab. Vor der Blutentnahme empfiehlt sich eine der
Tierart angemessene Futterkarenz. Es wird empfohlen, Bestimmungen insbesondere für folgende Parameter
durchzuführen: Calcium, Phosphor, Chlor, Natrium, Kalium, Nüchternglukose, Alanin-Aminotransferase,
Aspartat-Aminotransferase, Ornithindecarboxylase, Gammaglutamyl-Transpeptidase, Harnstoff-Stickstoff,
Albumin, Blutkreatinin, Gesamtbilirubin und Messungen des Serum-Gesamtproteins.
Untersuchungen zur Urinanalyse sind zumindest zu Beginn, anschließend zur Halbzeit und schließlich zum
Abschluss der Studie an zu festgelegten Zeiten gesammeltem Urin durchzuführen: Aussehen, Volumen,
Osmolarität oder spezifisches Gewicht, pH-Wert, Glukose und Blut/Blutzellen. Sofern erforderlich, können
zusätzliche Parameter verwendet werden, um die Untersuchung beobachteter Wirkungen zu erweitern.
Darüber hinaus sollten Untersuchungen zur Bestimmung von Serummarkern für eine allgemeine Gewebs-
schädigung erwogen werden. Sonstige Bestimmungen, die für eine angemessene toxikologische Bewertung
erforderlich sein können, umfassen Analysen von Lipiden, Hormonen, Säure-/Basengleichgewicht, Methämo-
globin und Cholinesteraseinhibitation. Weitere klinisch-biochemische Untersuchungen können, sofern erfor-
derlich, durchgeführt werden, um die Untersuchung der beobchteten Wirkungen zu erweitern. Die jeweili-
gen Parameter sind je nach Prüfsubstanzklasse bzw. von Fall zu Fall zu bestimmen.
Insgesamt ist je nach Versuchstierart und den beobachteten und/oder erwarteten Wirkungen der Prüfsub-
stanz mit der entsprechenden Flexibilität vorzugehen.
1.5.5.3. Autopsie
Alle an der Studie beteiligten Tiere müssen einer vollständigen, eingehenden Autopsie unterzogen werden,
die die sorgfältige Untersuchung der äußeren Körperoberfläche, aller Körperöffnungen sowie der Schädel-,
Brust- und Bauchhöhlen und ihres Inhalts umfasst. Leber und Gallenblase, Nieren, Nebennieren, Hoden,
Nebenhoden, Uterus, Eierstöcke, Schilddrüse, (mit Nebenschilddrüse), Thymus, Milz, Gehirn und Herz aller
Tiere (außer der tot aufgefundenen und/oder zwischenzeitlich getöten Tiere) sind in angemessener Form
von anhaftendem Gewebe zu befreien, und ihr Naßgewicht ist so rasch wie möglich nach der Sektion fest-
zustellen, um ein Austrocknen zu verhindern.
Die folgenden Gewebe sind in dem für Gewebsarten und die vorgesehene nachfolgende histopathologische
Untersuchung am besten geeigneten Fixierungsmedium aufzubewahren: alle Gewebe mit makroskopischen
Läsionen, Gehirn (repräsentative Bereiche, insbesondere Cerebrum, Cerebellum und Medulla/Pons), Rücken-
mark (auf drei Ebenen: cervical, mittlerer Thoraxbereich, und lumbar), Hypophyse, Augen, Schilddrüse,
Nebenschilddrüse, Thymusdrüse, Speiseröhre, Speicheldrüsen, Magen, Dünn- und Dickdarm (einschließlich
Peyer'schen Platten), Leber, Gallenblase, Bauchspeicheldrüse, Nieren, Nebennieren, Milz, Herz, Luftröhre und
Lungen, Aorta, Gonaden, Uterus akzessorische Geschlechtsorgane, weibliche Brustdrüsen, Prostata, Harn-
blase, Lymphknoten (vorzugsweise ein Lymphknoten des Verabreichungsweges und ein weiterer vom Ver-
abreichungsweg entfernter, um systemische Wirkungen abzudecken), periphere Nerven (N. ischiadicus oder
N. tibialis), vorzugsweise in der Nähe des Muskels, ein Knochenmarksschnitt (und/oder ein frisches Kno-

chenmark-Aspirat) und Haut. Die klinischen und sonstigen Befunde können weitere Gewebsuntersuchungen
erforderlich machen. Auch Organe, die aufgrund der bekannten Eigenschaften der Prüfsubstanz als mögliche
Zielorgane in Frage kommen, sollten aufbewahrt werden.
1.5.5.4. Histopathologische Untersuchungen
Bei allen Tieren der Gruppe mit der höchsten Dosis sowie bei den Tieren der Kontrollgruppe ist eine umfas-
sende histopathologische Untersuchung der konservierten Organe und Gewebe durchzuführen. Diese Unter-
suchungen sind auch auf die Tiere aller Dosisgruppen auszudehnen, wenn behandlungsbedingte Verände-
rungen in der Gruppe mit der höchsten Dosis festgestellt werden.
Alle makroskopischen Läsionen sind zu untersuchen.
Umfasst eine Prüfung auch eine Satellitengruppe, sind bei den Tieren dieser Gruppe die Gewebe und Organe
histopathologisch zu untersuchen, bei denen in den Behandlungsgruppen Wirkungen aufgetreten sind.
2. DATEN UND BERICHTERSTATTUNG
2.1. DATEN
Es sollten Daten für jedes einzelne Tier vorgelegt werden. Außerdem sollten alle Daten in Tabellenform
zusammengefasst werden, aus denen für jede Prüfgruppe folgende Daten hervorgehen: die Zahl der Tiere
bei Beginn der Prüfung und die Zahl der während der Prüfung tot aufgefundenen oder aus Gründen des
Tierschutzes getöteten Tiere, ferner der Zeitpunkt des eingetretenen Todes oder der aus Tierschutzgründen
vorgenommenen Tötung, die Zahl der Tiere, die Anzeichen von Toxizität aufweisen, eine Beschreibung der
beobachteten Toxizität, einschließlich des Zeitpunkts, zu dem die toxischen Wirkungen erstmalig aufgetre-
ten sind, deren Dauer und Schweregrad, die Zahl der Tiere mit Läsionen, die Art der Läsionen und der Pro-
zentsatz der davon betroffenen Tiere.
Wenn möglich sind die numerischen Daten durch eine geeignete allgemein annehmbare statistische
Methode auszuwerten. Die statistischen Methoden und die zu analysierenden Daten sollten bei der Planung
der Studie festgelegt werden.
2.2. PRÜFBERICHT
Der Prüfbericht muss folgende Informationen enthalten:
2.2.1. Prüfsubstanz:
Š physikalische Beschaffenheit, Reinheit und physikalisch-chemische Eigenschaften;
Š Identifizierungsdaten;
Š Vehikel (sofern zutreffend): Begründung der Wahl des Vehikel, sofern anders als Wasser.
2.2.2. Versuchstierart:
Š Tierart und Stamm;
Š Zahl, Alter und Geschlecht der Tiere;
Š Herkunft, Haltungsbedingungen, Futter usw.;
Š individuelles Gewicht der Tiere zu Beginn der Prüfung.
2.2.3. Prüfbedingungen:
Š Begründung der Wahl der Dosisstufen;
Š Einzelheiten der Formulierung der Prüfsubstanz/Futterzubereitung, erzielte Konzentration, Stabilität und
Homogenität der Zubereitung;

Š Angaben zur Verabreichung der Prüfsubstanz;
Š tasächliche Dosen (mg/kg Körpergewicht/Tag) und, sofern zutreffend, Angaben zur Umrechnung der
Konzentration der Prüfsubstanz im Futter/Trinkwasser (ppm) in die tatsächliche Dosis;
Š Einzelheiten der Futter- und Wasserqualität.
2.2.4. Ergebnisse:
Š Körpergewicht und Änderungen des Körpergewichts;
Š gegebenenfalls Angaben zur Futter- und Wasseraufnahme;
Š Daten der toxischen Wirkung nach Geschlecht und Dosis, einschließlich Toxizitätsanzeichen;
Š Art, Schweregrad und Dauer der klinischen Beobachtungen (mit Angaben zur Reversibilität);
Š Ergebnisse aus der ophthalmologische Untersuchung;
Š hämatologische Tests mit entsprechenden Normalwerten;
Š klinisch-biochemische Tests mit entsprechenden Normalwerten;
Š terminales Körpergewicht, Organgewichte und Verhältnis Organ-/Körpergewicht;
Š Sektionsbefunde;
Š ausführliche Beschreibung aller histopathologischen Befunde;
Š Absortionsdaten, sofern zutreffend;
Š statistische Bearbeitung der Ergebnisse, wenn möglich.
Diskussion der Ergebnisse.
Schlussfolgerungen

Anhang 5F
C.14. WACHSTUMSTEST AN JUNGFISCHEN
1. METHODE
Diese Methode für einen Wachstumstest zur Toxizitätsbestimmung entspricht der OECD TG 215 (2000).
1.1. EINLEITUNG
Anhand dieses Tests sollen die Auswirkungen einer lang anhaltenden Chemikalienexposition auf das Wachs-
tum von Jungfischen bewertet werden. Er beruht auf einer Methode, bei der die Auswirkungen von Chemika-
lien auf das Wachstum junger Regenbogenforellen (Oncorhynchus mykiss) unter Durchflussbedingungen
bewertet werden. Sie wurde in der Europäischen Union entwickelt und einem Ringtest unterzogen (1)(2). Auch
andere gut dokumentierte Spezies sind dafür geeignet. So liegen beispielsweise Erfahrungen mit Wachstums-
tests an Zebrabärblingen (Danio rerio) (2) (3)(4) und Reiskärpflingen (Medaka, Oryzias latipes) vor (5)(6)(7).
Siehe auch Allgemeine Einführung Teil C.
1.2. BEGRIFFSBESTIMMUNGEN
Lowest Observed Effect Concentration Š LOEC: (niedrigste Konzentration mit beobachteter Wirkung): die
geringste getestete Konzentration einer Prüfsubstanz, bei der verglichen mit den Kontrollen eine signifikante
Wirkung der Substanz zu beobachten ist (bei p < 0,05). Jedoch müssen alle Testkonzentrationen, die die LOEC
übersteigen, verglichen mit dieser eine ebenso große oder größere Schadwirkung haben.
No Observed Effect Concentration Š NOEC: Konzentration ohne beobachtete Wirkung): die Testkonzen-
tration unmittelbar unterhalb der LOEC.
ECx : bei dieser Testmethode ist dies die Konzentration der Prüfsubstanz, die verglichen mit den Kontrollen
eine Veränderung von x % in der Wachstumsrate der Fische hervorruft.
Besatzrate: Feuchtgewicht der Fische pro Volumen Wasser.
Besatzdichte: Zahl der Fische je Volumenteil Wasser.
Individuelle spezifische Wachstumsrate des Fisches: Wachstumsrate eines Individuums auf der Grundlage
seines Ausgangsgewichts.
Durchschnittliche spezifische Wachstumsrate je Behältnis: mittlere Wachstumsrate des Besatzes eines
Prüfgefäßes bei einer bestimmten Konzentration.
Pseudo-spezifische Wachstumsrate: Wachstumsrate eines einzelnen Fisches im Vergleich zum mittleren Aus-
gangsgewicht des Besatzes eines Prüfgefäßes.
1.3. PRINZIP DER PRÜFMETHODE
Jungfische in der Phase exponentiellen Wachstums werden nach dem Wiegen in Testkammern eingebracht
und einer Reihe subletaler Konzentrationen der in Wasser gelösten Prüfsubstanz ausgesetzt; dies geschieht vor-
zugsweise unter Durchflussbedingungen oder, sollte dies nicht möglich sein, unter geeigneten semistatischen
Bedingungen (statisch mit Erneuerung). Die Testdauer beträgt 28 Tage. Die Fische werden täglich gefüttert. Die
Futterration richtet sich nach dem Ausgangsgewicht der Fische und wird gegebenenfalls nach 14 Tagen neu
berechnet. Am Ende der Prüfung werden die Fische erneut gewogen. Die Auswirkungen auf die Wachstums-
raten werden anhand eines Regressionsmodells analysiert, um diejenige Konzentration zu ermitteln, die eine
Veränderung der Wachstumsrate von x % hervorruft, d. h. ECx (z. B. EC10 , EC20 oder EC30 ). Wahlweise können
die Daten mit denen von Kontrollgruppen verglichen werden, um die LOEC (niedrigste Konzentration mit
beobachteter Wirkung) und damit die NOEC (Konzentration ohne beobachtete Wirkung) zu bestimmen.
1.4. ANGABEN ZUR PRÜFSUBSTANZ
Es müssen die Ergebnisse einer Untersuchung der akuten Toxizität (siehe Prüfmethode C.1.) vorliegen, die vor-
zugsweise mit der für diesen Test ausgewählten Spezies durchgeführt wurde. Damit sind Wasserlöslichkeit und
Dampfdruck der Prüfsubstanz bekannt, und es steht eine zuverlässige Analysemethode zur Quantifizierung der
Substanz in den Testlösungen mit bekannter und dokumentierter Genauigkeit und bekannter Nachweisgrenze
zur Verfügung.

Weitere nützliche Informationen sind die Strukturformel, der Reinheitsgrad der Substanz, die Wasser- und
Lichtbeständigkeit, pKa , Pow und die Ergebnisse einer Prüfung auf leichte biologische Abbaubarkeit (siehe Prüf-
methode C. 4).
1.5. VALIDITÄT DES TESTS
Damit der Test gültig ist, müssen folgende Bedingungen gegeben sein:
Š Am Ende der Prüfung darf die Mortalität bei der (den) Kontrollgruppe(n) 10 % nicht überschreiten.
Š Das mittlere Gewicht der Fische in der (den) Kontrollgruppe(n) muss in einem solchen Maße zugenommen
haben, daß die für signifikant erachtete Mindestveränderung der Wachstumsrate nachgewiesen werden
kann. Ein Ringtest (2) hat ergeben, dass bei Regenbogenforellen das mittlere Gewicht der Fische in den
Kontrollgruppen im Laufe von 28 Tagen um mindestens die Hälfte (d. h. 50 %) des mittleren Ausgangs-
gewichts zugenommen haben muss. Beispiel: 1 g/Fisch (= 100 %), Abschlussgewicht nach 28 Tagen: > 1,5
g/Fisch (> 150 %).
Š Die Konzentration an gelöstem Sauerstoff muss für die gesamte Dauer des Tests mindestens 60 % des
Luftsauerstoff-Sättigungswerts betragen.
Š Für die Dauer des Tests dürfen sich die Wassertemperaturen im Vergleich zwischen den Testkammern zu
keiner Zeit um mehr als ± 1 °C unterscheiden und innerhalb des für die Testspezies festgelegten Tempera-
turbereichs um höchstens 2 °C schwanken (Anhang 1).
1.6. BESCHREIBUNG DER PRÜFMETHODE
1.6.1. Apparatur
Normale Laborgeräte, darunter insbesondere folgende:
a) Sauerstoff- und pH-Messgerät;
b) Geräte zur Bestimmung von Wasserhärte und -alkalität;
c) geeignete Geräte zur Temperaturregelung und vorzugsweise zur fortlaufenden Überwachung;
d) Behältnisse aus chemisch inertem Material und mit einem dem empfohlenen Besatz und der Besatzdichte
entsprechenden Fassungsvermögen (siehe Abschnitt 1.8.5 und Anhang 1);
e) Waage mit ausreichender Genauigkeit (d. h. auf ± 0.5 % genau).
1.6.2. Wasser
Als Testwasser eignet sich jedes Wasser, in dem ein ausreichend langes Überleben und ein ausreichendes
Wachstum der Testspezies möglich sind. Es muss für die Dauer des Tests von gleichbleibend guter Qualität
sein. Der pH-Wert des Wassers soll zwischen 6,0 und 8,5 liegen, jedoch während eines bestimmten Tests um
nicht mehr als ± 0.5 pH-Einheiten schwanken. Es wird eine Härte von mehr als 140 mg/l (als CaCO3 ) empfoh-
len. Um sicherzugehen, dass das Verdünnungswasser das Testergebnis nicht übermäßig stark beeinflusst (bei-
spielsweise durch Komplexierung der Prüfsubstanz), sind in gewissen Abständen Proben zur Analyse zu ent-
nehmen. Wenn bekannt ist, dass das Verdünnungswasser eine relativ konstante Qualität aufweist, sind bei-
spielsweise alle drei Monate der Gehalt an Schwermetallen (z. B. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd und Ni), an Hauptanionen
und -kationen (z. B. Ca, Mg, Na, K, Cl und SO4 ), Pestiziden (z. B. Gesamtgehalt an phosphororganischen und
chlororganischen Pestiziden), der gesamte organische Kohlenstoff und die Schwebstoffe zu bestimmen. Wenn
sich die Wasserqualität über mindestens ein Jahr als konstant erwiesen hat, können die Untersuchungen weni-
ger häufig und in größeren Zeitabständen (z. B. alle sechs Monate) erfolgen. Einige chemische Eigenschaften
eines geeigneten Verdünnungswassers sind in Anhang 2 genannt.
1.6.3. Testlösungen
Die Testlösungen mit den ausgewählten Konzentrationen werden durch Verdünnung einer Stammlösung her-
gestellt.
Die Stammlösung sollte vorzugsweise durch einfaches Mischen oder Einrühren der Prüfsubstanz in das Ver-
dünnungswasser mit mechanischen Mitteln (Rührwerk oder Ultraschall) hergestellt werden. Zur Herstellung
einer geeigneten konzentrierten Stammlösung können Sättigungssäulen (Löslichkeitssäulen) verwendet werden.
Zur Herstellung einer Stammlösung mit geeigneter Konzentration kann in einigen Fällen die Verwendung von
Lösungs- oder Dispergiermitteln (Lösungsvermittlern) erforderlich sein. Geeignete Lösungsmittel sind beispiels-
weise Aceton, Ethanol, Methanol, Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid und Triethylenglycol. Geeignete Dis-

pergiermittel sind beispielsweise Cremophor RH40, Tween 80, Methylcellulose 0,01 % und HCO-40. Bei der
Verwendung von biologisch leicht abbaubaren Stoffen (z. B. Aceton) und/oder leichtflüchtigen Stoffen ist Vor-
sicht geboten, da diese im Durchflusstest Probleme im Hinblick auf das Bakterienwachstum verursachen kön-
nen. Wird ein Lösungsvermittler verwendet, so darf er keine signifikanten Auswirkungen auf das Fischwachs-
tum und keine erkennbaren nachteiligen Auswirkungen auf die Jungfische haben, was durch eine nur mit
Lösungsmittel vorgenommene Kontrolle nachzuweisen ist.
Bei Durchflusstests ist ein System erforderlich, das kontinuierlich eine Stammlösung der Prüfsubstanz verdünnt
(z. B. Dosierpumpe, Proportionalverdünner, Sättigungsvorrichtung), um die Testkonzentrationen den Testkam-
mern zuzuführen. Die Durchflussgeschwindigkeiten der Stammlösungen und des Verdünnungswassers sind
während des Testverlaufs in bestimmten Abständen, vorzugsweise täglich, zu prüfen und sollten während der
gesamten Testdauer um nicht mehr als 10 % schwanken. Ein Ringtest (2) hat ergeben, dass es bei Regenbogen-
forellen vertretbar ist, wenn während des Testverlaufs 6 Liter Wasser/g Fisch/Tag ausgetauscht werden (siehe
1.8.2.2).
Bei semistatischen (Erneuerungs-) Tests hängt die Häufigkeit der Erneuerung des Mediums von der Stabilität
der Prüfsubstanz ab, doch wird eine tägliche Erneuerung des Wassers empfohlen. Hat sich bei vorherigen Sta-
bilitätstests (siehe 1.4) gezeigt, dass die Konzentration der Prüfsubstanz während des Erneuerungszeitraums
nicht stabil ist (d. h. nicht in einem Bereich von 80-120 % des Nominalwerts liegt oder auf weniger als 80 %
der gemessenen Ausgangskonzentration abfällt), so ist die Verwendung eines Durchflusstests in Erwägung zu
ziehen.
1.6.4. Auswahl der Spezies
Empfohlen wird für diesen Test die Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss), da beim Ringtest mit dieser Spe-
zies die meisten Erfahrungen gesammelt wurden (1)(3). Es kommen auch andere gut dokumentierte Spezies in
Frage, wobei jedoch das Testverfahren möglicherweise abgewandelt werden muss, um geeignete Testbedingun-
gen zu schaffen. Beispielsweise liegen auch Erfahrungen mit dem Zebrabärbling (Danio rerio) (4)(5) und dem
Reiskärpfling (Medaka, Oryzias latipes) (6)(7)(8) vor. Die Gründe für die Auswahl der Spezies und der Versuchs-
methode sind in diesem Fall genau zu dokumentieren.
1.6.5. Haltung der Fische
Die Versuchsfische sind aus einer Population eines einzelnen Stammes Š vorzugsweise vom selben Laich -
auszuwählen, die im Hinblick auf Wasserqualität und Beleuchtung vor dem Test mindestens zwei Wochen
lang unter ähnlichen Bedingungen gehalten wurde, wie sie beim Test verwendet werden. Sie werden während
der gesamten Dauer der Haltung und während des Tests mit einer Futtermenge von mindestens 2 %, vorzugs-
weise aber 4 %, ihres Körpergewichts gefüttert.
Nach einer 48Œstündigen Eingewöhnungsphase wird die Mortalität festgehalten, wobei folgende Kriterien gel-
ten:
Š Mortalität größer als 10 % der Population in sieben Tagen: Austausch aller Fische;
Š Mortalität zwischen 5 und 10 % der Population in sieben Tagen: weitere sieben Tage Akklimatisation;
wenn die Mortalität innerhalb der folgenden sieben Tage bei mehr als 5 % liegt: Austausch des gesamten
Besatzes;
Š Mortalität weniger als 5 % der Population in sieben Tagen: Verwendung aller Fische für den Test.
Die Fische sollen zwei Wochen vor dem Test und während des Tests nicht wegen irgendwelcher Erkrankungen
behandelt werden.
1.7. VERSUCHSAUFBAU
Unter —Versuchsaufbaui. sind die gewählte Anzahl und der Abstand der Testkonzentrationen, die Anzahl der
Prüfgefäße je Konzentration und die Anzahl der Fische je Gefäß zu verstehen. Nach Möglichkeit sollte die Aus-
wahl der Versuchsanordnung anhand folgender Kriterien erfolgen:
a) Ziel der Studie;
b) vorgesehene Methode der statistischen Analyse;
c) Verfügbarkeit und Kosten der experimentellen Ressourcen.
In der Erklärung zur Zielsetzung ist nach Möglichkeit die statistische Trennschärfe anzugeben, mit der ein
Unterschied bestimmter Größenordnung (z. B. in der Wachstumsrate) nachgewiesen werden soll; wahlweise
kann die Genauigkeit angegeben werden, mit der EC x (z. B. x = 10, 20 oder 30, vorzugsweise nicht unter 10)
ermittelt werden soll. Ohne diese ist keine feste Angabe zum Umfang der Studie nicht möglich.

Es ist zu beachten, dass ein Versuchsaufbau, der für eine bestimmte Methode der statistischen Analyse optimal
ist (d. h. die bestmögliche Nutzung der Ressourcen gestattet), dies nicht unbedingt auch für eine andere
Methode sein muss. Daher wird für die Ermittlung der LOEC/NOEC nicht derselbe Aufbau empfohlen wie für
die Regressionsanalyse.
Aus Gründen, die von Stephan und Rogers (9) erörtert werden, ist in den meisten Fällen die Regressionsana-
lyse der Varianzanalyse vorzuziehen. Falls jedoch kein geeignetes Regressionsmodell zur Verfügung steht (r 2 <
0,9), ist die NOEC/LOEC zu verwenden.
1.7.1. Versuchsaufbau für die Regressionsanalyse
Bei der Planung eines Tests, der mittels Regressionsanalyse ausgewertet werden soll, ist folgendes zu beachten:
a) Die im Test verwendeten Konzentrationen müssen in jedem Falle die Wirkungskonzentration (z.B.
EC10 ,20,30 ) und den Konzentrationsbereich, in dem die Wirkung der Prüfsubstanz von Interesse ist, ein-
schließen. Bei der Bestimmung von Wirkungskonzentrationen wird die größte Genauigkeit dann erzielt,
wenn die Wirkungskonzentration in der Mitte des Bereichs der getesteten Konzentrationen liegt. Ein Vor-
versuch kann die Auswahl geeigneter Testkonzentrationen erleichtern.
b) Im Interesse einer zufriedenstellenden statistischen Modellierung sind bei dem Test mindestens ein Kon-
trollansatz und fünf weitere Gefäße mit unterschiedlichen Konzentrationen zu verwenden. Gegebenenfalls
ist bei Verwendung eines Lösungsvermittlers zusätzlich zur Testreihe ein Kontrollansatz mitzuführen , der
den Lösungsvermittler in der höchsten eingesetzten Konzentration enthält (siehe 1.8.3 und 1.8.4).
c) Es kann eine geeignete geometrische Reihe oder logarithmische Reihe (10) (siehe Anhang 3) verwendet
werden. Ein logarithmischer Abstand zwischen den Testkonzentrationen ist zu bevorzugen.
d) Stehen mehr als sechs Prüfgefäße zur Verfügung, so sind die überzähligen Gefäße entweder für Parallel-
tests zu verwenden oder so über den Konzentrationsbereich zu verteilen, dass sich der Abstand zwischen
den Konzentrationen verringert. Beide Maßnahmen sind gleichermaßen zu empfehlen.
1.7.2. Versuchsaufbau für die Bestimmung der NOEC/LOEC mittels Varianzanalyse
Vorzugsweise sollten bei allen Konzentrationen Parallelansätze vorhanden sein, und die statistische Analyse
sollte für die einzelnen Prüfgefäße vorgenommen werden (11). Ohne Parallelansätze ist es nicht möglich, die
Variabilität zwischen den Prüfgefäßen über das auf die einzelnen Fische zurückzuführende Maß hinaus zu
berücksichtigen. Bei einer Untersuchung (12) wurde jedoch die Erfahrung gemacht, dass die Variabilität zwi-
schen den Gefäßen im Vergleich zur Variabilität innerhalb der Prüfgefäße (d. h. zwischen den Fischen) sehr
gering war. Daher besteht eine durchaus vertretbare Alternative darin, eine statistische Analyse für die einzel-
nen Fische vorzunehmen.
In der Regel werden mindestens fünf Testkonzentrationen in einer geometrischen Reihe verwendet, wobei der
Faktor vorzugsweise nicht größer als 3,2 ist.
Wird der Test mit Parallelansätzen durchgeführt, so gilt im Allgemeinen, dass die Zahl der zur Kontrolle ver-
wendeten Parallelgefäße und damit die Zahl der Fische jeweils doppelt so groß sein soll wie bei den einzelnen
Testkonzentrationen, bei denen die Zahl wiederum jeweils gleich sein soll (13)(14)(15). Werden dagegen keine
Parallelgefäße verwendet, so soll die Zahl der Fische in der jeweiligen Kontrollgruppe mit der Zahl der Fische
in der jeweiligen Testkonzentration übereinstimmen.
Wenn die Varianzanalyse für die Prüfgefäße und nicht auf die einzelnen Fische bezogen durchgeführt werden
soll (wobei letzteres entweder eine Markierung der einzelnen Fische oder die Verwendung —pseudoir-spezi-
fischer Wachstumsraten voraussetzen würde (siehe 2.1.2)), müssen so viele Prüfgefäße für Paralleltests vorhan-
den sein, dass die Standardabweichung der —Gefäße innerhalb der einzelnen Konzentrationenin bestimmt wer-
den kann. Dies bedeutet, dass die Freiheitsgrade für Fehler in der Varianzanalyse mindestens 5 (11) betragen
sollten. Bei alleiniger Replikation der Kontrollen besteht die Gefahr einer Beeinflussung der Fehlervariabilität,
da sie zusammen mit dem mittleren Wert der fraglichen Wachstumsrate ansteigen kann. Da die Wachstums-
rate aller Wahrscheinlichkeit nach mit steigender Konzentration abnimmt, hat dies zur Folge, dass die Varia-
bilität zu hoch eingeschätzt wird.
1.8. VERFAHREN
1.8.1. Auswahl und Wiegen der Versuchsfische
Zu Beginn des Tests kommt es darauf an, die Unterschiede im Gewicht der Fische möglichst gering zu halten.
In Anhang 1 werden geeignete Größenbereiche für die einzelnen Spezies angegeben, deren Verwendung in
diesem Test empfohlen wird. Beim gesamten im Test verwendeten Fischbesatz sollen die Unterschiede im

Gewicht der einzelnen Fische am Anfang des Tests möglichst nicht mehr als ± 10 % des arithmetischen Mittels
betragen und in keinem Falle 25 % übersteigen. Es wird empfohlen, vor dem Test zwecks Bestimmung des
mittleren Gewichts eine Teilstichprobe von Fischen zu wiegen.
Die Fütterung der Stammpopulation ist in den 24 Stunden vor dem Test auszusetzen Anschließend erfolgt
eine Zufallsauswahl der Fische. Unter Verwendung eines allgemeinen Anästhetikums (z. B. einer wässrigen
Lösung von 100 mg/l Tricainmethansulphonat (MS 222), die durch Zugabe von zwei Teilen Natriumhydro-
gencarbonat pro Teil MS 222 neutralisiert wird), werden die (trockengetupften) Fische einzeln gewogen, um
das Feuchtgewicht mit der in Anhang 1 angegebenen Genauigkeit zu ermitteln. Diejenigen Fische, deren
Gewicht innerhalb des ausgewählten Bereichs liegt, sind verwendbar und werden willkürlich auf die Testbehält-
nisse aufgeteilt. Das Gesamtfeuchtgewicht der Fische in jedem Testbehältnis ist festzuhalten. Die Verwendung
eines Anästhetikums und die Handhabung der Fische (darunter das Trockentupfen und Wiegen) können bei
den Jungfischen Streß und Verletzungen hervorrufen, was insbesondere für kleinwüchsige Spezies gilt. Daher
sind die Jungfische mit äußerster Vorsicht zu behandeln, um eine Belastung und Verletzung der Versuchstiere
zu vermeiden.
Am 28. Tag des Tests werden die Fische erneut gewogen (siehe 1.8.6). Wird jedoch eine neuerliche Berech-
nung der Futterration für notwendig erachtet, können die Fische am 14. Tag des Tests erneut gewogen werden
(siehe 1.8.2.3). Es können auch andere Methoden wie beispielsweise die fotografische Längenmessung verwen-
det werden, um Größenänderungen bei den Fischen zu ermitteln, auf deren Grundlage die Futterrationen ange-
passt werden.
1.8.2. Expositionsbedingungen
1.8.2.1. Dauer
Die Testdauer beträgt Å 28 Tage.
1.8.2.2. Besatzrate und Besatzdichte
Wichtig ist, dass die Besatzrate und Besatzdichte der jeweils verwendeten Testspezies angepasst sind (siehe
Anhang 1). Die bei einer zu hohen Besatzdichte entstehende Enge ruft Stress hervor, der eine Verringerung
der Wachstumsrate und unter Umständen Erkrankungen zur Folge haben kann. Eine zu niedrige Besatzdichte
kann Auslöser für Revierverhalten sein, wodurch ebenfalls das Wachstum beeinträchtigt werden kann. In
jedem Falle sollte die Besatzrate so niedrig sein, dass ohne Belüftung eine Konzentration an gelöstem Sauerstoff
von mindestens 60 % des Luftsauerstoff-Sättigungswerts aufrechterhalten werden kann. Ein Ringtest (3) hat
ergeben, dass bei Regenbogenforellen eine Besatzrate von 16 Forellen von 3Š5 g auf jeweils 40 Liter vertret-
bar ist. Es wird empfohlen, für die Dauer des Tests 6 l Wasser/g Fisch/Tag auszutauschen.
1.8.2.3. Fütterung
Die Fische sind mit geeignetem Futter (Anhang 1) in einer Menge zu füttern, die eine annehmbare Wachstums-
rate ermöglicht. Das Wachstum von Mikroorganismen sowie Wassertrübungen sind sorgfältig zu vermeiden.
Bei Regenbogenforellen dürfte dies mit einer täglichen Futterration von 4 % des Körpergewichts zu erreichen
sein (3)(16)(17)(18). Die Tagesration kann in zwei gleiche Teile aufgeteilt und den Fischen in zwei Fütterungen
pro Tag im Abstand von mindestens fünf Stunden verabreicht werden. Die Ration richtet sich nach dem jewei-
ligen Gesamt-Ausgangsgewicht der Fische in den einzelnen Testbehältnissen. Werden die Fische am 14. Tag
erneut gewogen, so erfolgt die Neuberechnung der Ration zu diesem Zeitpunkt. Die Fütterung ist 24 Stunden
vor dem Wiegen auszusetzen.
Nicht gefressenes Futter und Exkremente werden täglich vom Boden der Prüfgefäße sorgfältig abgesaugt.
1.8.2.4. Licht und Temperatur
Fotoperiode und Wassertemperatur sind der Testspezies anzupassen (Anlage 1).
1.8.3. Testkonzentrationen
Normalerweise werden unabhängig vom Testaufbau fünf Konzentrationen der Prüfsubstanz benötigt (siehe
1.7.2). Eine vorherige Bestimmung der Toxizität der Prüfsubstanz (z. B. durch Akuttests und/oder einen Vor-
versuch zur Ermittlung eines geeigneten Konzentrationsbereiches) erleichtert die Auswahl der Testkonzentra-
tionen. Werden weniger als fünf Konzentrationen verwendet, so ist dies zu begründen. Die höchste getestete
Konzentration darf die Löslichkeitsgrenze der Substanz in Wasser nicht überschreiten.

Wird ein Lösungsvermittler verwendet, so soll dessen Konzentration nicht mehr als 0,1 ml/l betragen und vor-
zugsweise in allen Testbehältnissen identisch sein (siehe 1.6.3). Die Verwendung solcher Stoffe sollte allerdings
möglichst vermieden werden.
1.8.4. Kontrollen
Die Zahl der mit Verdünnungswasser vorgenommenen Kontrollen ist vom Testaufbau abhängig (siehe
1.7Š1.7.2). Bei Verwendung eines Lösungsvermittlers sind mit diesem ebenso viele Kontrollen durchzuführen
wie mit dem Verdünnungswasser.
1.8.5. Häufigkeit der analytischen Bestimmungen und Messungen
Für die Dauer des Tests werden die Konzentrationen der Prüfsubstanz in regelmäßigen Abständen bestimmt
(siehe unten).
Beim Durchflusstest sind die Durchflussgeschwindigkeiten des Verdünnungswassers und der Stammlösungen
des Giftstoffes in regelmäßigen Abständen Š vorzugsweise täglich Š zu überprüfen und dürfen während der
gesamten Testdauer um höchstens 10 % schwanken. Ist damit zu rechnen, dass die Konzentrationen der Prüf-
substanz um höchstens ± 20 % des Nominalwertes schwanken (d. h. im Bereich von 80Š120 % liegen; siehe
1.6.2 und 1.6.3), so wird empfohlen, mindestens die höchste und die niedrigste Testkonzentration zu Beginn
des Tests und danach in wöchentlichen Abständen zu analysieren. Ist bei einem Test (aufgrund der Stabilitäts-
daten der Prüfsubstanz) nicht damit zu rechnen, dass die Konzentration der Prüfsubstanz um höchstens ±
20 % des Nominalwertes schwankt, müssen sämtliche Testkonzentrationen analysiert werden, wobei dieselbe
Vorgehensweise anzuwenden ist.
Ist bei einem semistatischen (Erneuerungs-) Test damit zu rechnen, dass die Konzentration der Prüfsubstanz
um höchstens ± 20 % des Nominalwerts schwankt, so wird empfohlen, mindestens die höchste und die nied-
rigste Testkonzentration zu Beginn der Studie sofort nach der Zubereitung und unmittelbar vor der Erneue-
rung sowie anschließend wöchentlich zu analysieren. Ist bei einem Test nicht damit zu rechnen, dass die Kon-
zentration der Prüfsubstanz um höchstens ± 20 % des Nominalwertes schwankt, müssen sämtliche Testkonzen-
trationen analysiert werden, wobei dieselbe Vorgehensweise anzuwenden ist wie bei den stabileren Substanzen.
Es wird empfohlen, bei der Berechnung der Ergebnisse von den gemessenen Konzentrationen auszugehen. Lie-
gen jedoch Nachweise dafür vor, daß die Konzentration der gelösten Prüfsubstanz für die Dauer des gesamten
Tests in zufriedenstellender Weise in einem Bereich von + 20 % des Nominalwertes oder der gemessenen Aus-
gangskonzentration gehalten wurde, kann vom Nennwert oder vom gemessenen Wert ausgegangen werden.
Es kann erforderlich sein, die Proben zu filtrieren (z. B. unter Verwendung einer Porengröße von 0,45 lm)
oder zu zentrifugieren. Das empfohlene Verfahren ist die Zentrifugation. Allerdings ist auch die Filtration
zulässig, sofern es nicht zur Adsorption des Testmaterials am Filter kommt.
Während des Tests sind in allen Testbehältnissen der gelöste Sauerstoff, der pH-Wert und die Temperatur zu
messen. In den Kontrollgefäßen und einem Prüfgefäß mit der höchsten Konzentration sind die Gesamthärte,
-alkalität und -salinität (falls zutreffend) zu messen. Der gelöste Sauerstoff und die Salinität (falls zutreffend)
sind mindestens dreimal zu messen (zu Beginn, in der Mitte und am Ende des Tests). Bei semistatischen Tests
wird empfohlen, den gelösten Sauerstoff häufiger zu messen, vorzugsweise vor und nach jedem Wasseraus-
tausch, mindestens aber einmal wöchentlich. Der pH-Wert ist beim semistatischen Test zu Beginn und Ende
jedes Wasseraustauschs und beim Durchflusstest mindestens wöchentlich zu messen. Härte und Alkalität sind
bei jedem Test je einmal zu messen. Die Temperatur sollte vorzugsweise in mindestens einem Testgefäß fort-
laufend überwacht werden.
1.8.6. Anmerkungen
Gewicht: Am Ende des Tests sind alle überlebenden Fische zur Ermittlung des Feuchtgewichts (trockengetupft)
entweder als Gruppe je Testgefäß oder einzeln zu wiegen. Das Wiegen der Tiere je Testgefäß ist zu bevor-
zugen, da das individuelle Wiegen eine vorherige individuelle Kennzeichnung der Fische erfordern würde. Wer-
den die Fische einzeln gewogen, um ihre individuellen spezifischen Wachstumsraten zu ermitteln, so sollte die
Kennzeichnungsmethode die Tiere möglichst wenig belasten (eventuell kommen Alternativen zum Gefrier-
brand in Frage, z. B. die Verwendung von dünner farbiger Angelschnur).
Für die Dauer des Tests sind die Fische täglich zu untersuchen und jegliche äußerliche Abnormitäten (wie Blu-
tungen, Verfärbungen) und abnorme Verhaltensweisen aufzuzeichnen. Die Mortalität ist festzuhalten, und tote
Fische sind so schnell wie möglich zu entfernen. Tote Fische werden nicht ersetzt, da die Besatzrate und
Besatzdichte so gewählt sind, daß Änderungen in der Zahl der Fische je Prüfgefäß keine Auswirkungen auf das
Wachstum haben. Es ist jedoch eine Anpassung der Futtermenge erforderlich.

2. DATEN UND BERICHTERSTATTUNG
2.1. BEHANDLUNG DER ERGEBNISSE
Es wird die Mitwirkung eines Statistikers bei der Festlegung des Testaufbaus wie auch bei der Analyse der Test-
ergebnisse empfohlen, da die Versuchsanordnungen bei dieser Testmethode stark variieren können, so bei-
spielsweise was die Zahl der Testkammern, der Testkonzentrationen, der Fische usw. anbelangt. In Anbetracht
der verschiedenen Möglichkeiten des Testaufbaus wird hier auf eine konkrete Anleitung zum statistischen Ver-
fahren verzichtet.
Für Testgefäße, in denen die Mortalität 10 % übersteigt, werden keine Wachstumsraten berechnet. Dennoch
sind die Mortalitätsraten für sämtliche Testkonzentrationen anzugeben.
Das Grundkonzept bei sämtlichen Analysemethoden ist die Ermittlung der spezifischen Wachstumsrate r zwi-
schen Zeitpunkt t1 und Zeitpunkt t2 . Diese kann in Abhängigkeit davon, ob die Fische einzeln gekennzeichnet
sind oder ob ein Durchschnittswert je Prüfgefäß errechnet werden muss, unterschiedlich definiert werden.
r1 = logew2 ¯ logew1
t2 ¯ t1 × 100
r2 = logew2 ¯ logew1
t2 ¯ t1 × 100
r3 = logew2 ¯ logew1
t2 ¯ t1 × 100
wobei
r1 = individuelle spezifische Wachstumsrate des Fisches
r2 = durchschnittliche spezifische Wachstumsrate je Gefäß
r3 = —pseudois-spezifische Wachstumsrate
w1 , w2 = Gewicht eines bestimmten Fisches zum Zeitpunkt t1 bzw. t2
loge w1 = Logarithmus des Gewichts eines einzelnen Fisches am Anfang des Untersuchungszeitraumes
loge w2 = Logarithmus des Gewichts eines einzelnen Fisches am Ende des Untersuchungszeitraumes
log e w 1 = Durchschnitt der Logarithmen der Werte w1 für die Fische im Gefäß am Anfang des Unter-
suchungszeitraumes
log e w 2 = Durchschnitt der Logarithmen der Werte w2 für die Fische im Gefäß am Ende des Untersuchungs-
zeitraumes
t1 , t2 = Zeitpunkt (Tage) am Anfang und Ende des Untersuchungszeitraumes
r1 , r2 , r3 kann für den Zeitraum von 0-28 Tagen und gegebenenfalls (d. h. wenn am 14. Tag eine Messung
erfolgt) für die Zeiträume von 0-14 und 14-28 Tagen berechnet werden.
2.1.1. Analyse der Ergebnisse mittels Regression (Konzentrations-Wirkungs-Modell)
Diese Analysemethode stellt eine geeignete mathematische Beziehung zwischen der spezifischen Wachstums-
rate und der Konzentration her und ermöglicht damit die Bestimmung von —ECx iE, d. h. eines beliebigen
gewünschten EC-Wertes. Bei Verwendung dieser Methode ist die Berechnung von r für den einzelnen Fisch (r1 )
nicht notwendig, vielmehr kann bei der Analyse vom Durchschnitt je Gefäß (r2 ) ausgegangen werden. Letztere
Methode wird bevorzugt. Im Falle sehr kleiner Spezies ist sie auch besser geeignet.
Zur Untersuchung der Beziehung zwischen Konzentration und Wirkung werden die durchschnittlichen spezi-
fischen Wachstumsraten je Gefäß (r2 ) graphisch als Funktion der Konzentration dargestellt.

Für die Darstellung der Beziehung zwischen r2 und Konzentration ist ein geeignetes Modell zu wählen, und
die Auswahl ist angemessen zu begründen.
Ist die Zahl der überlebenden Fische in den einzelnen Prüfgefäß unterschiedlich, ist das Verfahren der Modell-
anpassung, ob einfach oder nichtlinear, zwecks Berücksichtigung der ungleichen Gruppengrößen zu gewich-
ten.
Die Methode der Modellanpassung muss beispielweise eine Schätzung der EC20 und ihrer Streuung (entweder
Standardfehler oder Vertrauensintervall) ermöglichen. Die Abbildung des angepaßten Modells ist im Verhältnis
zu den Daten zu zeigen, um die Eignung der Anpassung zu verdeutlichen (9)(19)(20)(21).
2.1.2. Analyse der Ergebnisse zur Bestimmung der LOEC
Waren bei dem Test auf allen Konzentrationsstufen Parallelgefäße vorhanden, so kann die LOEC mittels
Varianzanalyse der durchschnittlichen spezifischen Wachstumsrate je Gefäß bestimmt werden (siehe 2.1),
wonach der Durchschnitt r bei jeder Konzentration anhand einer geeigneten Methode (z. B. Dunnett-Test oder
Williams-Test (13)(14)(15)(22)) mit dem Durchschnitt r der Kontrollgruppen verglichen wird, um die geringste
Konzentration zu ermitteln, bei der der Unterschied mit einer Wahrscheinlichkeit von 0,05 signifikant ist. Sind
die Voraussetzungen für eine parametrische Methode nicht gegeben (durch Nichtnormalverteilung (z. B. Sha-
piro-Wilk-Test) oder heterogene Varianzen (Bartlett-Test)), so sollte vor der Varianzanalyse zwecks Homogeni-
sierung der Varianzen eine Transformation der Daten erfolgen oder aber eine gewichtete Varianzanalyse
durchgeführt werden.
Waren nicht bei jeder Konzentration Parallelgefäße vorhanden, ist eine von den einzelnen Gefäßen ausgehende
Varianzanalyse unempfindlich oder nicht möglich. In diesem Falle besteht eine annehmbare Kompromißlösung
darin, bei der Varianzanalyse die —pseudoin-spezifische Wachstumsrate r3 für die einzelnen Fische zu verwen-
den.
Der Durchschnitt r3 für die einzelnen Testkonzentrationen kann dann mit dem Durchschnitt r3 für die Kon-
trollgruppen verglichen werden. Anschließend wird die LOEC wie oben ermittelt. Zu beachten ist, dass es bei
dieser Methode nicht möglich ist, die Variabilität zwischen den Prüfgefäßen über das auf die einzelnen Fische
zurückzuführende Maß hinaus zu berücksichtigen oder sich in dieser Hinsicht abzusichern. Es wurde jedoch
die Erfahrung gemacht (9), dass die Variabilität zwischen den Gefäßen im Vergleich zur Variabilität innerhalb
der Gefäße (d. h. zwischen den Fischen) sehr gering war. Werden keine einzelnen Fische in die Analyse ein-
bezogen, so ist die verwendete Methode zur Ermittlung von Ausreißern anzugeben und zu begründen.
2.2. INTERPRETATION DER ERGEBNISSE
Die Ergebnisse sind mit Vorsicht zu interpretieren, wenn die gemessenen Substanzkonzentrationen in den
Testlösungen nahe an der Nachweisegrenze des Analysenverfahrens liegen bzw. wenn bei semistatischen Tests
die Konzentration der Prüfsubstanz in der Zeit zwischen der Zubereitung und der Erneuerung abnimmt.
2.3. TESTBERICHT
Der Testbericht muss folgende Angaben enthalten:
2.3.1. Prüfsubstanz:
Š physikalischer Zustand und relevante physikalisch-chemische Eigenschaften;
Š chemische Kenndaten einschließlich Reinheitsgrad und gegebenenfalls Analyseverfahren zur Quantifizie-
rung der Prüfsubstanz.
2.3.2. Testspezies:
Š wissenschaftliche Bezeichnung (nach Möglichkeit);
Š Stamm, Größe, Herkunft, eventuelle Vorbehandlungen usw.
2.3.3. Prüfbedingungen:
Š verwendetes Prüfverfahren (z. B. semistatisch/ Erneuerung, Durchflussverfahren, Besatz, Besatzdichte usw.);
Š Versuchsaufbau (z. B. Zahl der Testgefäße, der Testkonzentrationen und der Parallelansätze, Zahl der
Fische pro Gefäß);

Š Methode der Zubereitung der Stammlösungen und Erneuerungshäufigkeit (falls verwendet, müssen Anga-
ben zum Lösungsvermittler und seiner Konzentration gemacht werden);
Š die nominellen Testkonzentrationen, der Durchschnitt der gemessenen Werte und deren Standardabwei-
chungen in den Testgefäßen sowie das Verfahren, durch das diese ermittelt wurden; Nachweise dafür, dass
sich die Messungen auf die Konzentrationen der Prüfsubstanz in echter Lösung beziehen;
Š Eigenschaften des Verdünnungswassers: pH-Wert, Härte, Alkalität, Temperatur, Konzentration des gelösten
Sauerstoffs, Restchlor (falls gemessen), gesamter organischer Kohlenstoff, suspendierte Feststoffe, Salinität
des Testmediums (falls gemessen) sowie alle sonstigen durchgeführten Messungen;
Š Wasserqualität innerhalb der Testgefäße: pH-Wert, Härte, Temperatur und Konzentration des gelösten Sau-
erstoffs;
Š ausführliche Angaben zur Fütterung (z. B. Art des Futters, Herkunft, Fütterungsmenge und -häufigkeit).
2.3.4. Ergebnisse:
Š Nachweis dafür, dass die Kontrollgruppen die Validitätskriterien für das Überleben erfüllen, sowie Daten
zur Mortalität bei allen Testkonzentrationen;
Š verwendete statistische Analysemethoden, statistische Angaben auf der Basis von Parallelgefäßen oder ein-
zelnen Fischen, Aufbereitung der Daten und Begründung der verwendeten Methoden;
Š tabellarische Angaben zum individuellen und durchschnittlichen Gewicht der Fische an den Tagen 0, 14
(falls gemessen) und 28, Werte für durchschnittliche spezifische Wachstumsraten je Gefäß oder (gegebe-
nenfalls) pseudo-spezifische Wachstumsraten für den Zeitraum 0-28 Tage bzw. 0-14 und 14-28 Tage;
Š Ergebnisse der statistischen Analyse (d. h. Regressionsanalyse oder Varianzanalyse), vorzugsweise in tabel-
larischer und graphischer Form, sowie LOEC (p = 0,05) und NOEC oder nach Möglichkeit ECx , gegebe-
nenfalls mit Standardfehlern;
Š festgestellte ungewöhnliche Reaktionen der Fische und erkennbare Auswirkungen der Prüfsubstanz.
3. LITERATUR
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ANLAGE 1
FÜR DIE PRÜFUNG EMPFOHLENE FISCHSPEZIES UND GEEIGNETE PRÜFBEDINGUNGEN

(Tabelle)

ANLAGE 2
EINIGE CHEMISCHE EIGENSCHAFTEN VON GEEIGNETEM VERDÜNNUNGSWASSER

ANLAGE 3
LOGARITHMISCHE REIHE GEEIGNETER KONZENTRATIONEN FÜR DEN TOXIZITÄTSTEST (9)
Spalte (Anzahl der Konzentrationen zwischen 100 und 10 oder zwischen 10 und 1) ( 1 )

( 1 ) Es können fünf (oder mehr) aufeinanderfolgende Konzentrationen aus einer Spalte gewählt werden. Die Mittelpunkte zwischen den Konzentrationen in Spalte (x) sind Spalte (2x + 1) zu entnehmen. Die aufgeführten Konzentrationen können Volumen- oder Gewichtsprozent (mg/l oder lg/l) darstellen. Die Werte können gegebenenfalls mit jeder beliebigen Zehnerpotenz multipliziert bzw. durch sie dividiert werden. Spalte 1 kann verwendet werden, wenn erhebliche Unsicherheit hinsichtlich des Toxititätsgrades besteht.

C.15. FISCHE, KURZFRISTIGE TOXIZITÄTSPRÜFUNG AN EMBRYONEN UND JUNGFISCHEN MIT
DOTTERSACK
1. METHODE
Diese Methode zur kurzfristigen Toxizitätsprüfung entspricht der OECD TG 212 (1998).
1.1. EINLEITUNG
Diese kurzfristige Toxizitätsprüfung an Fischembryonen und Jungfischen mit Dottersack stellt eine kurzfristige
Prüfung dar, bei der die Entwicklungsstadien vom frisch befruchteten Ei bis zum Ende des Dottersackstadiums
exponiert werden. Bei der Prüfung an Fischembryonen und Jungfischen mit Dottersack erfolgt keine Fütterung,
daher sollte die Prüfung abgeschlossen sein, solange sich die Larven noch aus dem Dottersack ernähren.
Die Prüfung soll zur Ermittlung der letalen und Š in gewissem Umfang Š auch der subletalen Auswirkungen
von Chemikalien auf die spezifischen Entwicklungsstadien und geprüften Fischarten dienen. Sie soll insofern
nützliche Informationen liefern, als sie a) eine Brücke zwischen letalen und subletalen Prüfungen schlagen, b)
als Screening-Test für eine Durchführung des vollständigen Early Life-Stage Tests oder für einen chronischen
Toxizitätstest verwendet und c) für die Prüfung von Fischarten herangezogen werden könnte, bei denen die
Zuchtverfahren noch nicht hinreichend weit entwickelt sind, um die Zeit der Umstellung von der endogenen
auf die exogene Fütterung abzudecken.
Nicht vergessen werden sollte, dass nur Prüfungen, die alle Entwicklungsstadien von Fischen umfassen, im All-
gemeinen eine korrekte Schätzung der chronischen Toxizität von Chemikalien für Fische ermöglichen und dass
eine verkürzte Exposition in bezug auf Entwicklungsstadien unter Umständen zu einer Herabsetzung der Emp-
findlichkeit und damit zu einer Unterschätzung der chronischen Toxizität führen kann. Es wird daher erwartet,
dass die Empfindlichkeit bei der Prüfung an Fischembryonen und Jungfischen mit Dottersack geringer als in
einer vollständigen Prüfung des frühen Entwicklungsstadiums ist, insbesondere bei Chemikalien mit einer
hohen Lipophilizität (log Pow > 4) und Chemikalien mit einer spezifischen toxischen Wirkungsweise. Kleinere
Unterschiede in der Empfindlichkeit zwischen zwei Tests dürften allerdings bei Chemikalien mit einer unspezi-
fischen narkotischen Wirkungsweise (1) zu erwarten sein.
Vor der Veröffentlichung dieser Prüfung lagen die meisten Erfahrungen mit Fischembryonen und Dottersack-
jungfischen des Süßwasserfischs Danio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae Š allgemeinsprach-
licher Name: Zebrabärbling) vor. Detailliertere Angaben zur Versuchsdurchführung bei dieser Fischart finden
sich daher in Anlage 1. Dadurch wird die Verwendung von anderen Fischarten, mit denen ebenfalls Erfahrun-
gen vorliegen (Tabellen 1A und 1B), nicht ausgeschlossen.
1.2. DEFINITIONEN
Lowest Observed Effect Concentration (LOEC): Dies ist die niedrigste geprüfte Konzentration einer Prüf-
substanz, bei der sich im Vergleich zu der Kontrolle eine signifikante Wirkung beobachten lässt (bei p < 0,05).
Alle Prüfkonzentrationen oberhalb der LOEC müssen jedoch eine schädigende Wirkung haben, die gleich den
bei der LOEC beobachteten Wirkungen oder größer als diese ist.
No Observed Effect Concentration (NOEC): Dies ist die Prüfkonzentration unmittelbar unterhalb der
LOEC.
1.3. PRINZIP DER METHODE
Die Fischembryonen und Jungfische mit Dottersack werden einem Bereich von Konzentrationen der in Wasser
gelösten Prüfsubstanz ausgesetzt. Im Rahmen des Protokolls kann zwischen einem semistatischen und einem
Durchflussverfahren gewählt werden. Die Entscheidung über das Verfahren hängt dabei von der Art der Prüf-
substanz ab. Die Prüfung beginnt damit, dass befruchtete Eier in die Prüfkammern gesetzt werden, und sie
endet kurz bevor der Dottersack von Larven in einer der Prüfkammern vollständig aufgezehrt ist beziehungs-
weise bevor die Tiere in den Kontrollen zu verhungern anfangen. Letale und subletale Auswirkungen werden
bewertet und mit Kontrollwerten zur Bestimmung der niedrigsten beobachteten Wirkkonzentration (LOEC)
und damit auch der höchsten Konzentration ohne Wirkung (NOEC) verglichen. Alternativ können sie auch
mit Hilfe eines Regressionsmodells analysiert werden, um die Konzentrationen zu schätzen, die zu einer Wir-
kung mit einem bestimmten prozentualen Anteil führen würden (d. h., LC/ECx, wobei x für den prozentualen
Anteil, der von der Wirkung betroffen ist, steht).
1.4. INFORMATIONEN ÜBER DIE PRÜFSUBSTANZ
Ergebnisse einer akuten Toxizitätsprüfung (siehe Methode C.1), die möglichst an der für diese Prüfung gewähl-
ten Fischart durchgeführt wurde, sollten zur Verfügung stehen. Die Ergebnisse können bei der Auswahl eines
geeigneten Bereichs an Prüfkonzentrationen bei der Prüfung in den frühen Entwicklungsstadien hilfreich sein.
Die Wasserlöslichkeit (einschließlich Löslichkeit im Prüfwasser) und der Dampfdruck der Prüfsubstanz sollten
bekannt sein. Ein zuverlässiges analytisches Verfahren für die Quantifizierung der Substanz in den Prüflösun-
gen mit bekannter und protokollierter Genauigkeit und Nachweisgrenze sollte verfügbar sein.

Zu den Informationen über die Prüfsubstanz, die bei der Festlegung der Prüfbedingungen von Nutzen sein
können, gehören die Strukturformel, die Reinheit der Substanz, die Lichtstabilität, die Stabilität unter den Ver-
suchsbedingungen, pKa, Pow und die Ergebnisse einer Prüfung zur leichten biologischen Abbaubarkeit (siehe
Methode C.4).
1.5. VALIDITÄTSKRITERIEN
Damit die Validität einer Prüfung gegeben ist, gelten die folgenden Bedingungen:
Š Die gesamte Überlebensrate von befruchteten Eiern in den Kontrollen und, soweit zutreffend, in den
Gefäßen, in denen sich ausschließlich Lösemittel befindet, muss größer oder gleich den in den Anlagen 2
und 3 definierten Grenzwerten sein.
Š Die Konzentration an gelöstem Sauerstoff muss während der gesamten Prüfung zwischen 60 und 100 %
des Luftsauerstoff-Sättigungswertes liegen.
Š Die Wassertemperatur darf zwischen den Prüfkammern oder zwischen aufeinander folgenden Tagen zu
keiner Zeit während der Prüfung um mehr als ± 1,5° C schwanken und sollte innerhalb der für die
geprüfte Fischart festgelegten Temperaturbereiche liegen (Anlagen 2 und 3).
1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE
1.6.1. Prüfkammern
Verwendet werden können beliebige Gefäße aus Glas oder einem anderen chemisch inerten Werkstoff. Die
Abmessungen der Gefäße sollten der Besatzrate entsprechend groß genug sein (siehe 1.7.1.2). Es wird empfoh-
len, die Prüfkammern nach dem Zufallsprinzip in dem Prüfbereich anzuordnen. Einem randomisierten Block-
konzept, bei dem jede Behandlung in jedem Block vorhanden ist, ist der Vorzug vor einem vollständig rando-
misierten Konzept zu geben, wenn systemische Wirkungen in der Prüfeinrichtung vorhanden sind, die durch
die Blockbildung kontrolliert werden können. Der Blockbildung sollte, sofern sie zum Tragen kommt, bei der
anschließenden Datenauswertung Rechnung getragen werden. Die Prüfkammern sind vor ungewollten Störun-
gen zu schützen.
1.6.2. Auswahl der Fischarten
Empfohlene Fischarten werden in Tabelle 1A genannt. Dies schließt die Verwendung anderer Fischarten (Bei-
spiele hierzu finden sich in Tabelle 1B) zwar nicht aus, doch ist das Prüfverfahren unter Umständen anzupas-
sen, um geeignete Prüfbedingungen zu schaffen. In diesem Fall sollten die Beweggründe für die Auswahl der
Fischart und das Versuchsverfahren protokolliert werden.
1.6.3. Haltung der Zuchtfische
Nähere Angaben, wie man die Zuchtfische unter zufriedenstellenden Bedingungen hält, lassen sich in der
OECD TG 210 ( 1 ) und in den Literaturhinweisen (2)(3)(4)(5)(6) finden.

1.6.4. Handhabung von Embryonen und Larven
Embryonen und Larven können innerhalb des Hauptgefäßes in kleineren Behältern exponiert werden, die mit
Siebseiten oder -enden versehen sind, damit die Prüflösung durch das Gefäß hindurchfließen kann. Einen wir-
belfreien Durchfluss durch diese kleinen Gefäße kann man dadurch herbeiführen, dass man diese an einen
Arm aufhängt, der das Gefäß auf- und abbewegt, dabei jedoch die Organismen immer mit der Prüflösung
bedeckt hält; ebenfalls verwendet werden kann ein Siphonspülsystem. Befruchtete Eier von Salmonidfischen
können auf Einschüben oder Gittern gehältert werden, deren Öffnungen groß genug sind, so dass die Larven
nach dem Schlüpfen hindurchfallen können. Pasteurpipetten eignen sich, um die Embryonen und Larven in
den semistatischen Prüfungen mit vollständigem täglichem Wechsel des Prüfmediums zu entfernen (siehe
1.6.6).
Werden Eierbehälter, Gitter oder Siebe verwendet, um die Eier innerhalb des Hauptprüfgefäßes zu halten, soll-
ten diese Rückhaltevorrichtungen nach dem Schlüpfen der Larven entfernt werden ( 1 ); Siebe sollten nur blei-
ben, um die Fische an der Flucht zu hindern. Sofern die Larven umgesetzt werden müssen, sollten sie nicht
der Luft ausgesetzt werden, und es sollten keine Netze verwendet werden, um Fische aus Eierbehältern heraus-
zuholen (derartige Vorsicht ist bei weniger anfälligen Arten wie beispielsweise Karpfen gegebenenfalls nicht
erforderlich). Der Zeitpunkt für diese Umsetzung ist von Art zu Art unterschiedlich, und ein Umsetzen ist
auch nicht immer erforderlich. Für das semistatische Verfahren können Bechergläser oder flache Behälter ver-
wendet werden, die bei Bedarf mit einem leicht über dem Boden des Becherglases erhöhten Sieb versehen sind.
Ist das Fassungsvermögen dieser Behälter für die Besatzanforderungen (siehe 1.7.1.2) ausreichend, brauchen
die Embryonen oder Larven gegebenenfalls nicht umgesetzt zu werden.

1.6.5. Wasser
Jedes Wasser, das die chemischen Eigenschaften eines annehmbaren Verdünnungswassers entsprechend der
Auflistung in Anlage 4 erfüllt und bei dem die zu prüfende Fischart eine Kontrollüberlebensrate aufweist, die
zumindest so gut wie in den Anlagen 2 und 3 beschrieben ist, kommt als Prüfwasser in Frage. Das Wasser
sollte während des Prüfzeitraums von gleichbleibender Qualität sein. Der pH-Wert sollte in einem Bereich von
± 0,5 pH-Einheiten bleiben. Um sicherzustellen, dass das Verdünnungswasser das Prüfergebnis nicht über-
mäßig beeinflusst (beispielsweise durch Komplexbildung mit der Prüfsubstanz) oder sich nachteilig auf die Leis-
tung des Zuchtbestands auswirkt, sollten in Abständen Proben zur Analyse entnommen werden. Messungen
von Schwermetallen (z. B. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd und Ni), größeren Anionen und Kationen (z. B. Ca, Mg, Na, K,
Cl und SO4 ), Pestiziden (z. B. gesamte phosphororganische und gesamte chlororganische Pestizide), des gesam-
ten organischen Kohlenstoffs (TOC) und der Schwebstoffe sollten beispielsweise alle drei Monate ermittelt wer-
den, wenn bekanntermaßen ein Verdünnungswasser von relativ gleichbleibender Qualität vorliegt. Hat sich die
Wasserqualität über einen Zeitraum von mindestens einem Jahr als relativ konstant erwiesen, können Bestim-
mungen seltener durchgeführt und die Abstände verlängert werden (z. B. alle sechs Monate).
1.6.6. Prüflösungen
Prüflösungen der gewählten Konzentrationen werden durch Verdünnung eines Stammansatzes hergestellt.
Der Stammansatz sollte möglichst durch einfaches Mischen oder Hin- und Herbewegen der Prüfsubstanz in
dem Verdünnungswasser auf mechanischem Wege hergestellt werden (z. B. Rühren und Ultraschalldispersion).
Sättigungskolonnen (Löslichkeitskolonnen) können verwendet werden, um einen Stammansatz von geeigneter
Konzentration zu erzielen. Soweit möglich, sollte der Einsatz von Löse- oder Dispersionsmitteln (Lösungsmit-
tel) vermieden werden; allerdings können derartige Verbindungen in einigen Fällen erforderlich sein, um einen
Stammansatz von geeigneter Konzentration herzustellen. Beispiele für geeignete Lösemittel sind Aceton, Etha-
nol, Methanol, Dimethylformamid und Triethylenglycol. Beispiele für geeignete Dispersionsmittel sind Cremo-
phor RH40, Tween 80, Methylcellulose 0,01 % und HCO-40. Vorsicht ist bei leicht biologisch abbaubaren (z.
B. Aceton) und/oder hochflüchtigen Stoffen geboten, da diese Probleme mit einer Anreicherung von Bakterien
in Durchflussprüfungen bereiten können. Wird ein Löslichkeitshilfsmittel verwendet, darf dieses weder eine sig-
nifikante Auswirkung auf das Überleben noch erkennbare negative Auswirkungen auf frühe Entwicklungspha-
sen haben, was durch eine Kontrolle, bei der nur das Lösemittel verwendet wird, nachgewiesen wird. Es sollten
jedoch alle Anstrengungen unternommen werden, um den Einsatz derartiger Stoffe zu vermeiden.
Bei dem semistatischen Verfahren können zwei verschiedene Verfahren zur Erneuerung des Prüfmediums ein-
gesetzt werden; entweder i) werden neue Prüflösungen in sauberen Gefäßen hergestellt und überlebende Eier
und Larven vorsichtig zusammen mit einer kleinen Menge der alten Lösung in die neuen Behälter umgesetzt,
wobei eine Exposition gegenüber Luft vermieden wird, oder ii) die Prüforganismen bleiben in den Gefäßen,
während ein Teil (mindestens drei Viertel) des Prüfwassers ausgetauscht wird. Die Häufigkeit der Erneuerung
des Prüfmediums hängt zwar von der Stabilität der Prüfsubstanz ab, jedoch wird ein täglicher Austausch des
Wassers empfohlen. Wenn aus vorausgehenden Stabilitätsprüfungen (siehe 1.4) bekannt ist, dass die Konzen-
tration der Prüfsubstanz während des Zeitraums, in dem das Prüfmedium gewechselt wird, nicht stabil ist (d.
h., außerhalb des Bereichs von 80 bis 120 % der nominalen Konzentration oder Unterschreitung von 80 % der
gemessenen anfänglichen Konzentration), sollte der Einsatz einer Durchflussprüfung in Erwägung gezogen
werden. In jedem Fall sollte darauf geachtet werden, dass während des Wasserwechsels Stress für die Larven
vermieden wird.
Bei Durchflussprüfungen ist ein System erforderlich, das einen Stammansatz der Prüfsubstanz kontinuierlich
abgibt und verdünnt (z. B. Dosierpumpe, Proportionalverdünnungsvorrichtung, Sättigersystem), um den Prüf-
kammern eine Reihe von Konzentrationen zuzuführen. Die Durchsatzraten der Stammansätze und des Ver-
dünnungswassers sollten in Abständen, möglichst einmal pro Tag, überprüft werden und während der gesam-
ten Prüfung um nicht mehr als 10 % schwanken. Eine Durchsatzrate, die zumindest dem fünffachen Kammer-
volumen in 24 Stunden entspricht, hat sich als geeignet erwiesen (2).
1.7. VORGEHENSWEISE
Nützliche Informationen über die Durchführung von Toxizitätsprüfungen an Fischembryonen und Jungtieren
mit Dottersack finden sich in der Fachliteratur, einige Beispiele hierfür sind im Abschnitt Literaturhinweise die-
ses Texts enthalten (7) (8) (9).
1.7.1. Expositionsbedingungen
1.7.1.1. Dauer
Die Prüfung sollte möglichst innerhalb von 30 Minuten nach der Befruchtung der Eier beginnen. Die Embryo-
nen werden vor oder so bald wie möglich nach Beginn des Stadiums der Blastulascheiben-Spaltung und auf
jeden Fall vor Einsetzen des Gastrula-Stadiums in die Prüflösung eingetaucht. Bei Eiern von kommerziellen Lie-
feranten ist es unter Umständen nicht möglich, die Prüfung unmittelbar nach der Befruchtung zu beginnen.
Da die Empfindlichkeit der Prüfung durch einen verzögerten Prüfbeginn gravierend beeinflusst werden kann,
sollte die Prüfung innerhalb von 8 Stunden nach der Befruchtung eingeleitet werden. Da die Larven während

des Expositionszeitraums nicht gefüttert werden, sollte die Prüfung kurz bevor der Dottersack von Larven in
einer der Prüfkammern vollständig aufgezehrt ist beziehungsweise bevor in den Kontrollen Tiere zu verhun-
gern anfangen, beendet sein. Die Dauer hängt dabei von der verwendeten Art ab. Einige Empfehlungen zur
Dauer finden sich in den Anlagen 2 und 3.
1.7.1.2. Besatz
Die Anzahl an befruchteten Eiern bei Beginn der Prüfung sollte zur Erfüllung von statistischen Anforderungen
hinreichend groß sein. Die Eier sollten nach dem Zufallsprinzip auf die Behandlungen verteilt werden, und
mindestens 30 befruchtete Eier sollten, zu gleichen Teilen (oder so gleich wie möglich, da es bei Einsatz von
einigen Arten schwierig sein kann, gleiche Chargen zu bekommen) auf mindestens drei parallele Prüfkammern
aufgeteilt, je Konzentration verwendet werden. Die Besatzrate (Biomasse je Volumen an Prüflösung) sollte
gering genug sein, so daß eine Konzentration an gelöstem Sauerstoff von mindestens 60 % des Luftsauerstoff-
Sättigungswerts ohne Belüftung aufrechterhalten werden kann. Bei Durchflussprüfungen wurde eine Besatzrate
von nicht mehr als 0,5 g/l je 24 Stunden und nicht mehr als 5 g/l Lösung zu jeder Zeit empfohlen (2).
1.7.1.3. Licht und Temperatur
Die Belichtungsdauer und die Prüfwassertemperatur sollten für die geprüfte Fischart angemessen sein (Anlagen
2 und 3). Zur Überwachung der Temperatur kann die Verwendung eines weiteren Prüfgefäßes angebracht
sein.
1.7.2. Prüfkonzentrationen
Im Normalfall sind fünf Konzentrationen der Prüfsubstanz, die sich durch einen konstanten Faktor von nicht
mehr als 3,2 voneinander unterscheiden, erforderlich. Die Kurve, in der die LC50 gegen den Expositionszeit-
raum in der akuten Prüfung aufgetragen ist, sollte bei der Auswahl des Bereichs an Prüfkonzentrationen
berücksichtigt werden. Die Verwendung von weniger als fünf Konzentrationen, beispielsweise in Limit-Tests,
und ein engerer Konzentrationsbereich können unter gewissen Umständen angebracht sein. Werden weniger
als fünf Konzentrationen verwendet, sollte dies begründet werden. Konzentrationen der Substanz, die höher
als die LC50 über 96 Stunden beziehungsweise 100 mg/l sind, je nachdem, welcher Wert der niedrigere ist,
brauchen nicht geprüft zu werden. Substanzen sollten nicht oberhalb ihrer Löslichkeitsgrenze im Prüfwasser
geprüft werden.
Wird ein Lösungsmittel bei der Herstellung der Prüflösungen verwendet (siehe 1.6.6), sollte dessen Endkonzen-
tration in den Prüfgefäßen nicht mehr als 0,1 ml/l betragen und in allen Prüfgefäßen gleich sein.
1.7.3. Kontrollen
Eine Kontrolle mit Verdünnungswasser (mit der entsprechenden Anzahl von Wiederholungen) und ebenfalls,
soweit relevant, eine Kontrolle mit dem Lösungsmittel (mit der entsprechenden Anzahl von Wiederholungen)
sollten zusätzlich zu der Testreihe durchgeführt werden.
1.7.4. Häufigkeit von analytischen Bestimmungen und Messungen
Während der Prüfung werden die Konzentrationen der Prüfsubstanz in regelmäßigen Abständen bestimmt.
Bei semistatischen Prüfungen, bei denen erwartet wird, daß die Konzentration der Prüfsubstanz innerhalb von
± 20 % der Nominalkonzentration konstant bleibt (d. h. innerhalb des Bereichs von 80 bis 120 %; siehe 1.4
und 1.6.6), wird empfohlen, dass zumindest die höchste und die niedrigste Prüfkonzentration analysiert wer-
den, wenn diese frisch hergestellt ist und unmittelbar vor dem Austausch, und zwar zu mindestens drei gleich-
mäßig über die Prüfung verteilten Zeitpunkten sind (d. h., Analysen sollten anhand einer Probe derselben
Lösung erfolgen Š wenn diese frisch hergestellt ist und beim Austausch).
Bei Prüfungen, bei denen nicht damit zu rechnen ist, dass die Konzentration der Prüfsubstanz innerhalb von ±
20 % der Nominalkonzentration (d. h., der Grundlage von Stabilitätsdaten der Substanz) konstant bleibt, ist es
notwendig, alle Prüfkonzentrationen, frisch hergestellt und beim Austausch, zu analysieren, jedoch unter glei-
chen Verhältnissen (d. h. bei mindestens drei Gelegenheiten, die gleichmäßig über die Prüfung verteilt sind).
Die Bestimmung von Konzentrationen der Prüfsubstanz vor dem Austausch braucht nur an einem Wieder-
holungsgefäß bei jeder Prüfkonzentration durchgeführt zu werden. Konzentrationen sollten im Abstand von
nicht mehr als sieben Tagen bestimmt werden. Es wird empfohlen, dass Ergebnisse dabei auf gemessenen Kon-
zentrationen basieren. Kann jedoch nachgewiesen werden, dass die Konzentration der Prüfsubstanz während
der gesamten Prüfung zufriedenstellend innerhalb von ± 20 % der nominalen Konzentration oder gemessenen
Anfangskonzentration gehalten wurde, dann können Ergebnisse auf nominalen oder gemessenen Anfangswer-
ten basieren.
Bei Durchflussprüfungen ist ein ähnliches Probenahmeverfahren, wie für semistatische Prüfungen beschrieben,
angebracht (die Messung der —altenic Lösungen gilt in diesem Falle jedoch nicht). Dauert die Prüfung allerdings
länger als sieben Tage, ist es unter Umständen ratsam, die Anzahl an Probenahmen in der ersten Woche zu
erhöhen (d. h. drei Messreihen), um sicherzugehen, dass die Prüfkonzentrationen stabil bleiben.

Proben müssen gegebenenfalls zentrifugiert oder gefiltert werden (z. B. mit einer Porengröße von 0,45 lm).
Da jedoch weder die Zentrifugation noch die Filtration stets den nichtbioverfügbaren Teil der Prüfsubstanz
von dem bioverfügbaren Teil trennt, brauchen die Proben diesen Behandlungen nicht unterzogen zu werden.
Während der Prüfung sollten in allen Prüfgefäßen der gelöste Sauerstoff, der pH-Wert und die Temperatur
gemessen werden. Die Gesamthärte und der Salzgehalt (soweit relevant) sollten in den Kontrollen und einem
Gefäß mit der höchsten Konzentration gemessen werden. Der gelöste Sauerstoff und der Salzgehalt (soweit
relevant) sollten mindestens dreimal (zu Beginn, in der Mitte und am Ende der Prüfung) gemessen werden. Bei
semistatischen Prüfungen wird empfohlen, den gelösten Sauerstoff häufiger zu messen, möglichst vor und
nach jedem Wasseraustausch, oder zumindest einmal pro Woche. Der pH-Wert sollte zu Beginn und am Ende
eines jeden Wasserwechsels bei semistatischen Prüfungen und mindestens einmal pro Woche bei Durchfluss-
prüfungen gemessen werden. Die Härte sollte jeweils einmal pro Prüfung gemessen werden. Die Temperatur
sollte einmal pro Tag gemessen und zumindest in einem Prüfgefäß kontinuierlich überwacht werden.
1.7.5. Beobachtungen
1.7.5.1. Stadium der Embryonalentwicklung
Das Embryonalstadium (d. h. Gastrula-Stadium) zu Beginn der Exposition gegenüber der Prüfsubstanz sollte so
genau wie möglich überprüft werden. Dies kann mit Hilfe einer repräsentativen Probe von Eiern, die in geeig-
neter Form aufbewahrt und gereinigt wurden, erfolgen. Zur Beschreibung und Darstellung von Embryonalsta-
dien kann auch die Fachliteratur herangezogen werden (2)(5)(10)(11).
1.7.5.2. Schlüpfen und Überleben
Beobachtungen zum Schlüpfen und Überleben sollten zumindest einmal pro Tag erfolgen, und die jeweiligen
Zahlen sollten protokolliert werden. Zu Beginn der Prüfung können häufigere Beobachtungen (z. B. alle 30
Minuten in den ersten drei Stunden) wünschenswert sein, da in einigen Fällen Überlebenszeiten aussagefähiger
sein können als nur die Anzahl von Todesfällen (z. B. bei akuten toxischen Wirkungen). Sobald tote Embryo-
nen und Larven festgestellt werden, sollten diese unmittelbar entfernt werden, da sie sich rasch zersetzen kön-
nen. Äußerste Sorgfalt sollte bei der Entfernung von einzelnen toten Individuen aufgewendet werden, um
benachbarte Eier/Larven nicht zu stoßen oder körperlich zu beschädigen, da diese äußerst zart und empfind-
lich sind. Je nach Entwicklungsstadium gelten unterschiedliche Kriterien zur Bestimmung des Todes:
Š bei Eiern: insbesondere in den frühen Stadien ein deutlich erkennbarer Verlust an Lichtdurchlässigkeit
und eine Veränderung der Färbung, hervorgerufen durch Gerinnung und/oder Ausfällung von Eiweiß, was
zu einem weiß-opaken Aussehen führt;
Š bei Embryonen: fehlende Körperbewegung und/oder fehlender Herzschlag und/oder opake Verfärbung
bei Arten, bei denen die Embryonen im Normalfall durchsichtig sind;
Š bei Larven: Bewegungslosigkeit und/oder fehlende Atmung und/oder fehlender Herzschlag und/oder
weiß-opake Färbung des zentralen Nervensystems und/oder mangelnde Reaktion auf mechanische Reize.
1.7.5.3. Abnormes Aussehen
Die Anzahl der Larven, die eine abnorme Körperform und/oder Pigmentierung aufweisen, und das Stadium
der Dottersackaufzehrung sollten in angemessenen Abständen in Abhängigkeit der Dauer der Prüfung und der
Art der beschriebenen Abnormität protokolliert werden. Zu beachten ist, dass abnorme Embryonen und Lar-
ven auch von Natur aus auftreten und bei einigen Arten in der Größenordnung von mehreren Prozent bei der/
den Kontrolle(n) liegen können. Abnorme Tiere sollten aus den Prüfgefäßen nur dann entfernt werden, wenn
sie tot sind.
1.7.5.4. Abnormes Verhalten
Abnormitäten, z. B. Hyperventilation, unkoordiniertes Schwimmen und atypische Ruhe, sollten in angemesse-
nen Abständen in Abhängigkeit der Dauer der Prüfung protokolliert werden. Auch wenn sich diese Auswir-
kungen nur schwer quantifizieren lassen, können sie, sofern sie beobachtet werden, bei der Interpretation von
Mortalitätsdaten helfen, d. h., Informationen über die toxische Wirkungsweise der Substanz liefern.
1.7.5.5. Länge
Am Ende der Prüfung wird eine Messung der Einzellängen empfohlen; dabei kann die Standard-, die Gabe-
lungs- oder die Gesamtlänge verwendet werden. Kommt es jedoch zu Schwanzflossenfäule oder Flossenerosion,
sollten Standardlängen herangezogen werden. Im allgemeinen sollte in einer ordentlich durchgeführten Prü-
fung der Variationskoeffizient für die Länge unter den Wiederholungen in den Kontrollen 20 % sein.

1.7.5.6. Gewicht
Am Ende der Prüfung können die einzelnen Gewichte bestimmt werden; dabei sollten möglichst Trockenge-
wichte (24 Stunden bei 60 °C) vor Nassgewichten (trocken getupft) gemessen werden. Im allgemeinen sollte in
einer ordentlich durchgeführten Prüfung der Variationskoeffizient für das Gewicht unter den Wiederholungen
in den Kontrollen Ä 20 % sein.
Diese Beobachtungen führen zu einigen oder allen der folgenden Daten, die zur statistischen Auswertung zur
Verfügung stehen:
Š kumulative Mortalität;
Š Anzahl von gesunden Larven am Ende der Prüfung;
Š Zeit des Schlüpfbeginns und des Schlüpfendes (d. h. 90 % Schlüpfen in jeder Wiederholung);
Š Anzahl von Larven, die jeden Tag schlüpfen;
Š Länge (und Gewicht) der am Ende der Prüfung überlebenden Tiere;
Š Anzahl an Larven, die deformiert sind oder ein abnormes Aussehen aufweisen;
Š Anzahl von Larven, die abnormes Verhalten zeigen.
2. DATEN UND BERICHTERSTATTUNG
2.1. AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE
Es wird empfohlen, einen Statistiker sowohl an der Auslegung als auch an der Auswertung der Prüfung zu
beteiligen, da die Methode eine beträchtliche Bandbreite im Versuchskonzept zulässt, beispielsweise bei der
Anzahl an Prüfkammern, der Anzahl an Prüfkonzentrationen, der Ausgangszahl an befruchteten Eiern und der
gemessenen Parameter. In Anbetracht der für die Auslegung der Prüfung zur Verfügung stehenden Möglichkei-
ten wird an dieser Stelle keine konkrete Orientierung zu den statistischen Verfahren gegeben.
Sind LOEC/NOEC-Werte zu bestimmen, wird die Notwendigkeit bestehen, Streuungen innerhalb jeder Wieder-
holungsreihe durch eine Varianzanalyse (ANOVA) oder Kontingenztabellenverfahren zu analysieren. Für einen
Mehrfachvergleich zwischen den Ergebnissen bei den einzelnen Konzentrationen und den Ergebnissen der
Kontrollen ist möglicherweise die Dunnetsche Methode von Nutzen (12) (13). Weitere hilfreiche Beispiele sind
ebenfalls verfügbar (14) (15). Der Umfang der Wirkung, der mit ANOVA oder anderen Verfahren nachweisbar
ist (d. h. die Aussagefähigkeit der Prüfung) sollte berechnet und protokolliert werden. Zu beachten ist, dass
sich nicht alle in Abschnitt 1.7.5.6 aufgeführten Beobachtungen für eine statistische Auswertung mittels einer
ANOVA eignen. Die kumulative Mortalität und die Anzahl an gesunden Larven am Ende der Prüfung könnten
beispielsweise mit Hilfe von Probit-Methoden analysiert werden.
Sind LC/EC x -Werte zu bestimmen, sollte(n) (eine) geeignete Kurve(n) wie beispielsweise die logistische Kurve
an die Daten von Interesse mittels eines statistischen Verfahrens wie der Methode der kleinsten Quadrate oder
der nichtlinearen kleinsten Quadrate angepasst werden. Die Kurve(n) sollte(n) so parametriert werden, dass die
LC/ECx von Interesse und deren Standardfehler direkt abgeschätzt werden können. Dies wird die Berechnung
des Vertrauensbereichs rund um die LC/ECx deutlich erleichtern. Soweit keine guten Gründe dafür vorliegen,
anderen Vertrauensbereichen den Vorzug zu geben, sollte der zweiseitige 95 % Vertrauensbereich angegeben
werden. Das Anpassungsverfahren sollte möglichst einen Weg bieten, um die Signifikanz der mangelnden
Anpassung zu bewerten. Für die Anpassung von Kurven können graphische Methoden eingesetzt werden. Für
alle in Abschnitt 1.7.5.6 aufgeführten Beobachtungen kommt eine Regressionsanalyse in Frage.
2.2. INTERPRETATION DER ERGEBNISSE
Die Ergebnisse sollten mit Vorsicht interpretiert werden, wenn gemessene toxische Konzentrationen in Prüf-
lösungen in der Nähe der Nachweisgrenze des analytischen Verfahrens liegen. Die Interpretation von Ergebnis-
sen für Konzentrationen oberhalb der Wasserlöslichkeit der Substanz sollte ebenfalls mit Vorsicht erfolgen.
2.3. ABSCHLUSSBERICHT
Der Prüfbericht muss die folgenden Angaben enthalten:

2.3.1. Prüfsubstanz
Š Physikalische Beschaffenheit und relevante physikalisch-chemische Eigenschaften;
Š Daten zur chemischen Identifizierung, einschließlich Reinheitsgrad und analytisches Verfahren zur Quanti-
fizierung der Prüfsubstanz, soweit zutreffend.
2.3.2. Geprüfte Fischart
Š Wissenschaftlicher Name, Stamm, Anzahl an Elternfischen (d. h., wie viele Weibchen wurden für die erfor-
derlichen Zahlen an Eiern in der Prüfung verwendet), Herkunft und Art der Sammlung der befruchteten
Eier sowie anschließende Handhabung.
2.3.3. Prüfbedingungen
Š Zum Einsatz kommendes Prüfverfahren (z. B. semistatisches oder Durchflussverfahren, Zeitraum von der
Befruchtung bis zum Beginn der Prüfung, Besatz, usw.);
Š Belichtungszeit(en);
Š Auslegung der Prüfung (z. B. Anzahl der Prüfkammern und Wiederholungen, Anzahl an Embryonen je
Wiederholung);
Š Methode zur Herstellung von Stammansätzen und Häufigkeit der Erneuerung (sollte ein Lösungsmittel ver-
wendet werden, sind dieses Mittel und dessen Konzentration anzugeben);
Š die nominalen Prüfkonzentrationen, die Messwerte, deren Mittelwerte und deren Standardabweichungen
in den Prüfbehältern sowie das Verfahren, nach dem diese erzielt wurden, und, sofern die Prüfsubstanz in
Wasser bei Konzentrationen unterhalb der Prüfkonzentrationen löslich ist, es sollte der Nachweis geführt
werden, dass sich die Messungen auf die Konzentrationen der Prüfsubstanz in der Lösung beziehen;
Š Eigenschaften des Verdünnungswassers: pH-Wert, Härte, Temperatur, gelöste Sauerstoffkonzentration,
Restchlorgehalt (soweit gemessen), gesamter organischer Kohlenstoff (TOC), Schwebstoffe, Salzgehalt des
Prüfmediums (soweit gemessen) und eventuelle andere vorgenommene Messungen;
Š Wasserqualität innerhalb der Prüfgefäße: pH-Wert, Härte, Temperatur und gelöste Sauerstoffkonzentration.
2.3.4. Ergebnisse
Š Ergebnisse von eventuellen vorhergehenden Untersuchungen zur Stabilität der Prüfsubstanz;
Š Nachweis, dass die Kontrollen den allgemeinen Standard bezüglich der Annehmbarkeit der Überlebens-
raten für die geprüfte Fischart erfüllen (Anlagen 2 und 3);
Š Daten zu Mortalität/Überleben im Embryo- und Larvenstadium sowie Gesamtmortalität/-überleben;
Š Tage bis zum Schlüpfen und Anzahl geschlüpfter Tiere;
Š Angaben zur Länge (und zum Gewicht);
Š Vorkommen und Beschreibung morphologischer Abnormitäten, soweit zutreffend;
Š Vorkommen und Beschreibung von Auswirkungen auf das Verhalten, soweit zutreffend;
Š statistische Auswertung und Datenaufbereitung;
Š bei Tests, in denen zur Auswertung die ANOVA zum Einsatz kommt, die geringste Dosiskonzentration,
bei der eine Wirkung beobachtet wird (LOEC), bei p = 0,05 und die höchste Dosiskonzentration, bei der
keine Wirkung beobachtet wird (NOEC), für jede bewertete Reaktion, einschließlich einer Beschreibung
der herangezogenen statistischen Verfahren und eine Angabe zum Umfang der Wirkung, die ermittelt
werden konnte;
Š bei Tests, die unter Zuhilfenahme von Regressionsverfahren ausgewertet werden, die LC/EC x und Vertrau-
ensbereiche sowie ein Graph des angepassten Modells, das für deren Berechnung benutzt wurde;
Š Erklärung für eine eventuelle Abweichung von dieser Prüfmethode.

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TABELLE 1A: Für die Prüfung empfohlene Fischarten

TABELLE 1B: Beispiele für andere hinreichend dokumentierte Arten, die ebenfalls verwendet wurden

ANLAGE 1
ANLEITUNG ZUR DURCHFÜHRUNG EINER TOXIZITÄTSPRÜFUNG AN EMBRYONEN UND JUNGTIEREN
MIT DOTTERSACK DES ZEBRABÄRBLINGS (BRACHYDANIO RERIO)
EINFÜHRUNG
Der Zebrabärbling stammt von der Koromandelküste in Indien, wo er in schnellfließenden Strömen lebt. Er ist ein ver-
breiteter Aquarienfisch und gehört zur Familie der Karpfen; Informationen über seine Pflege und Kultur sind in Stan-
dardnachschlagewerken über tropische Fische zu finden. Die Biologie und die Verwendung des Zebrabärblings in der
Fischforschung wurden von Laale (1) besprochen.
Nur in seltenen Fällen erreicht der Fisch eine Länge von mehr als 45 mm. Sein Körper ist zylindrisch geformt mit 7 bis
9 dunkelblauen, waagerecht verlaufenden silbernen Streifen. Diese Streifen reichen bis in die Schwanz- und Afterflossen.
Der Rücken ist olivgrün gefärbt. Männchen sind schlanker als Weibchen. Bei Weibchen ist die silberne Färbung stärker
ausgeprägt, und ihr Bauch ist gebläht, vor allem vor dem Laichen.
Erwachsene Fische können große Schwankungen von Temperatur, pH-Wert und Härte vertragen. Um jedoch gesunde
Fische zu erhalten, die Eier von guter Qualität produzieren, sollte für optimale Bedingungen gesorgt werden.
Beim Laichen verfolgt und begattet das Männchen das Weibchen, und im Ausstoßen werden die Eier befruchtet. Die
Eier, die transparent sind und keinen klebrigen Stoff enthalten, fallen auf den Grund, wo sie von den Eltern aufgefressen
werden können. Das Laichen wird durch Licht beeinflusst. Bei entsprechendem Morgenlicht laichen die Fische im all-
gemeinen in den ersten Stunden nach Tagesanbruch.
Ein Weibchen kann im Abstand von einer Woche Chargen von mehreren Hundert Eiern produzieren.
BEDINGUNGEN FÜR ELTERNFISCHE, FORTPFLANZUNG UND FRÜHE ENTWICKLUNGSSTADIEN
Eine geeignete Anzahl von gesunden Fischen auswählen und mindestens 2 Wochen vor dem beabsichtigten Laichen in
geeignetem Wasser (z. B. Anlage 4) halten. Man sollte die Fischgruppe zumindest einmal brüten lassen, bevor sie die für
die Prüfung zu verwendende Charge an Eiern produzieren. Die Fischdichte sollte in diesem Zeitraum 1 Gramm Fische
je Liter nicht übersteigen. Durch einen regelmäßigen Wechsel des Wassers oder den Einsatz von Reinigungssystemen
läßt sich eine höhere Dichte erreichen. Die Temperatur in den Hälterungsbehältern sollte bei 25 ± 2 °C gehalten werden.
Den Fischen sollte abwechslungsreiche Nahrung geboten werden, die beispielsweise aus entsprechendem handelsübli-
chem Trockenfutter, lebenden frischgeschlüpften Arthemien, Chironomiden, Daphnien oder weißen Würmern (Enchyt-
raeiden) bestehen kann.
Im Folgenden werden zwei Verfahren in groben Zügen beschrieben, die in der Praxis eine ausreichende Charge von
gesunden befruchteten Eiern für eine durchzuführende Prüfung ergeben haben:
i) Acht Weibchen und 16 Männchen werden in einen Behälter mit 50 Litern Verdünnungswasser gesetzt, der vor
direktem Licht geschützt und nach Möglichkeit mindestens 48 Stunden lang ungestört gelassen wird. Auf den
Boden des Aquariums wird am Nachmittag des Tages, bevor die Prüfung beginnt, eine Laichschale gesetzt. Die
Laichschale besteht aus einem Rahmen (aus Plexiglas oder einem anderen geeigneten Material) und ist 5 bis 7 cm
hoch; am oberen Ende ist ein grobes Netz mit einer Maschenweite von 2 bis 5 mm befestigt, unten auf dem Boden
ein feines Netz mit einer Maschenweite von 10 bis 30 lm . An dem groben Netz des Rahmens wird eine Reihe
von —Laichbäumenis, die aus ungedrehtem Nylonfaden bestehen, befestigt. Nachdem die Fische 12 Stunden lang im
Dunkeln gelassen wurden, wird ein schwaches Licht eingeschaltet, welches das Laichen in Gang setzen wird. Zwei
bis vier Stunden nach dem Laichen wird die Laichschale entfernt und werden die Eier eingesammelt. Die Laich-
schale hindert die Fische daran, die Eier aufzufressen, und ermöglicht gleichzeitig ein einfaches Einsammeln der
Eier. Die Fischgruppe sollte zumindest einmal vor dem Laich, von dem Eier für die Prüfung verwendet werden,
gelaicht haben.
ii) Fünf bis zehn Männchen und Weibchen werden mindestens 2 Wochen vor dem beabsichtigten Laichen einzeln
gehalten. Nach 5 bis 10 Tagen sind die Bäuche der Weibchen gebläht und ihre Genitalpapillen sichtbar. Männliche
Fische besitzen keine Papillen. Das Laichen erfolgt in Laichbehältern, die mit einem eingeschobenen Gitterboden
ausgerüstet sind (wie oben). Der Behälter wird mit Verdünnungswasser gefüllt, so daß das Wasser 5 bis 10 cm über
dem Gitter steht. Am Tag vor dem beabsichtigten Laichen werden ein Weibchen und zwei Männchen in den Behäl-
ter gesetzt. Die Wassertemperatur wird schrittweise ein Grad über die Eingewöhnungstemperatur erhöht. Das Licht
wird ausgeschaltet, und der Behälter wird so ungestört wie möglich gelassen. Am Morgen wird ein schwaches Licht
eingeschaltet, welches das Laichen in Gang setzen wird. Nach 2 bis 4 Stunden werden die Fische entfernt und die
Eier eingesammelt. Werden größere Chargen von Eiern benötigt als von einem Weibchen gewonnen werden kön-
nen, kann eine hinreichende Anzahl von Laichbehältern parallel aufgestellt werden. Dadurch, daß man den Repro-
duktionserfolg der einzelnen Weibchen vor der Prüfung festhält (Größe der Charge und Qualität), können die Weib-
chen mit dem höchsten Reproduktionserfolg für die Zucht ausgewählt werden.

Die Eier sollten mit Hilfe von Glasröhrchen (mit einem Innendurchmesser von nicht weniger als 4 mm), die mit einem
flexiblen Saugkolben ausgestattet sind, in die Prüfgefäße umgesetzt werden. Dabei sollte die Menge Wasser, die zusam-
men mit den Eiern umgelagert wird, so gering wie möglich sein. Die Eier sind schwerer als Wasser und sinken aus dem
Röhrchen. Vorsicht ist geboten, damit die Eier (und Larven) nicht mit Luft in Berührung kommen. Es sollte eine mikro-
skopische Untersuchung von einer oder mehreren Proben von der/den Charge(n) durchgeführt werden, um sicherzuge-
hen, dass in den ersten Entwicklungsstadien keine Unregelmäßigkeiten vorliegen. Eine Desinfektion der Eier ist nicht
zulässig.
Die Mortalitätsrate der Eier ist in den ersten 24 Stunden nach der Befruchtung am höchsten. In dieser Zeit ist häufig
eine Mortalität von 5 bis 40 Prozent zu beobachten. Infolge einer erfolglosen Befruchtung oder aufgrund von Entwick-
lungsfehlern kommt es zur Degeneration von Eiern. Die Qualität der Eiercharge scheint dabei vom Fischweibchen abzu-
hängen; einige Weibchen produzieren gleichbleibend Eier von guter Qualität, andere tun das niemals. Auch die Entwick-
lungs- und Schlüpfrate ist von Charge zu Charge unterschiedlich. Erfolgreich befruchtete Eier und Dottersacklarven
überleben gut, normalerweise in einer Größenordnung von mehr als 90 Prozent. Bei einer Temperatur von 25 °C
schlüpfen die Eier 3 bis 5 Tage nach der Befruchtung, und der Dottersack ist etwa 13 Tage nach der Befruchtung auf-
gezehrt.
Die Embryonalentwicklung wurde von Hisaoka und Battle (2) gut bestimmt. Aufgrund der Transparenz der Eier und der
Larven nach dem Schlüpfen kann die Entwicklung der Fische verfolgt werden und lassen sich vorhandene Missbildungen
beobachten. Etwa 4 Stunden nach dem Laichen können unbefruchtete Eier von befruchteten unterschieden werden (3).
Zu dieser Untersuchung werden Eier und Larven in Prüfgefäße mit geringem Fassungsvermögen gesetzt und unter dem
Mikroskop untersucht.
Die für die frühen Entwicklungsstufen geltenden Prüfbedingungen sind in Anlage 2 aufgeführt. Optimal als pH-Wert
und Härte für das Verdünnungswasser sind 7,8 beziehungsweise 250 mg CaCO3 /l.
BERECHNUNGEN UND STATISTIK
Vorgeschlagen wird eine zweistufige Vorgehensweise. In einem ersten Schritt werden Daten zu Mortalität, abnormer
Entwicklung und Schlüpfzeit statistisch ausgewertet. Dann wird bei denjenigen Konzentrationen, bei denen keine negati-
ven Auswirkungen auf einen dieser Parameter festgestellt wurden, die Körperlänge statistisch bewertet. Diese Vorgehens-
weise ist ratsam, da der toxische Stoff kleinere Fisch selektiv töten, die Schlüpfzeit verlängern und grobe Mißbildungen
hervorrufen und somit zu einseitigen Längenmessungen führen kann. Außerdem soll in etwa die gleiche Anzahl von
Fischen für jede Behandlung vermessen werden, um die Validität der Prüfstatistik sicherzustellen.
BESTIMMUNG DER LC50 UND EC50
Der prozentuale Anteil an überlebenden Eiern und Larven wird berechnet und um die Mortalität in den Kontrollen nach
der Abbottschen Formel korrigiert (4):
P = 100 ¯ C ¯ P0
C × 100
 
Dabei gilt:
P = korrigierter prozentualer Anteil an überlebenden Eiern und Larven
P¡ = beobachteter prozentualer Anteil an überlebenden Eiern und Larven in der Prüfkonzentration,
C = prozentualer Anteil an überlebenden Eiern und Larven in der Kontrolle.
Soweit möglich, wird die LC50 am Ende der Prüfung mittels einer geeigneten Methode bestimmt.
Wird die Berücksichtigung von morphologischen Abnormitäten in der EC50 -Statistik gewünscht, finden sich dazu bei
Stephan (5) entsprechende Hinweise.
SCHÄTZUNG DER LOEC UND NOEC
Eine Zielsetzung, die mit der Prüfung an Eiern und Jungfischen im Dottersack verfolgt wird, besteht darin, die Konzen-
trationen, die nicht wirkungslos sind, mit der Kontrolle zu vergleichen, das heißt, die LOEC zu bestimmen. Aus diesem
Grunde sollten Mehrfachvergleichsverfahren zum Einsatz kommen (6) (7) (8) (9) (10).
LITERATURHINWEISE
(1) Laale H. W. (1977). The Biology and Use of the Zebrafish (Brachydanio rerio) in Fisheries Research. A Literature
Review. J. Fish Biol. 10, pp. 121-173.
(2) Hisaoka K. K. and Battle H. I. (1958). The Normal Development Stages of the Zebrafish Brachydanio rerio
(Hamilton-Buchanan) J. Morph., 102, 311 pp.
(3) Nagel R. (1986). Untersuchungen zur Eiproduktion beim Zebrabärbling (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan).
Journal of Applied Ichthyology, 2, pp. 173-181.
(4) Finney D. J. (1971). Probit Analysis, 3rd ed., Cambridge University Press, Great Britain, pp. 1-333.
(5) Stephan C. E. (1982). Increasing the Usefulness of Acute Toxicity Tests. Aquatic Toxicology and Hazard
Assessment: Fifth Conference, ASTM STP 766, J. G. Pearson, R. B. Foster and W. E. Bishop, Eds., American
Society for Testing and Materials, pp. 69-81.
(6) Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing Several Treatments with a Control. J.
Amer. Statist. Assoc., 50, pp. 1096-1121.
(7) Dunnett C. W. (1964). New Tables for Multiple Comparisons with a Control. Biometrics, 20, pp. 482-491.
(8) Williams D. A. (1971). A Test for Differences Between Treatment Means when Several Dose Levels are Compared
with a Zero Dose Control. Biometrics, 27, pp. 103-117.
(9) Williams D. A. (1972). The Comparison of Several Dose Levels with a Zero Dose Control. Biometrics 28, pp.
519-531.
(10) Sokal R. R. and Rohlf F. J. (1981). Biometry, the Principles and Practice of Statistics in Biological Research, W. H.
Freeman and Co., San Francisco.

ANLAGE 2
PRÜFBEDINGUNGEN, DAUER UND ÜBERLEBENSKRITERIEN FÜR EMPFOHLENE FISCHARTEN

(Tabelle)

ANLAGE 3
PRÜFBEDINGUNGEN, DAUER UND ÜBERLEBENSKRITERIEN FÜR ANDERE HINREICHEND DOKUMENTIERTE FISCHARTEN

(Tabelle)

ANLAGE 4
VERSCHIEDENE CHEMISCHE EIGENSCHAFTEN EINES ANNEHMBAREN VERDÜNNUNGSWASSERS

C.16. HONIGBIENEN Š AKUTE ORALE TOXIZITÄTSPRÜFUNG
1. METHODE
Diese Methode zur Prüfung der akuten Toxizität entspricht der OECD TG 213 (1998).
1.1. EINLEITUNG
Diese Toxizitätsprüfung ist ein Laborverfahren, mit dem die akute orale Toxizität von Pflanzenschutzmitteln
und anderen Chemikalien für erwachsene Arbeitshonigbienen bewertet werden soll.
Bei der Bewertung und Beurteilung der toxischen Merkmale von Substanzen ist unter Umständen die Bestim-
mung der akuten oralen Toxizität bei Bienen erforderlich, beispielsweise wenn die Wahrscheinlichkeit einer
Exposition von Bienen gegenüber einer bestimmten Chemikalie besteht. Die akute orale Toxizitätsprüfung wird
durchgeführt, um die spezifische Toxizität von Pestiziden und anderen Chemikalien für Bienen zu bestimmen.
Die Ergebnisse dieser Prüfung sollten herangezogen werden, um festzulegen, ob weiterer Beurteilungsbedarf
besteht. Diese Methode kann insbesondere in schrittweise aufgebauten Programmen zur Bewertung der Gefah-
ren von Pflanzenschutzmitteln für Bienen verwendet werden, die auf einem sequenziellen Übergang von
Labortoxizitätsprüfungen auf Halbfreiland- und Freilandversuche beruhen (1). Pestizide können dabei als Wirk-
stoffe oder als formulierte Produkte geprüft werden.
Zur Überprüfung der Empfindlichkeit der Bienen und der Genauigkeit des Prüfverfahrens sollte ein toxischer
Standard verwendet werden.
1.2. BEGRIFFSBESTIMMUNGEN
Akute orale Toxizität: Dies sind die negativen Wirkungen, die innerhalb eines Zeitraums von maximal 96
Stunden bei einer oralen Verabreichung einer einfachen Dosis der Prüfsubstanz auftreten.
Dosis: Dies ist die aufgenommene Menge an Prüfsubstanz. Die Dosis wird als Masse (lg) Prüfsubstanz je Prüf-
tier ausgedrückt (lg/Biene). Die tatsächliche Dosis für jede einzelne Biene kann zwar nicht berechnet werden,
da die Bienen gemeinsam gefüttert werden, es läßt sich jedoch eine durchschnittliche Dosis abschätzen (ins-
gesamt aufgenommene Prüfsubstanz/Anzahl der Testbienen in einem Käfig).
Orale LD50 (mittlere letale Dosis): Dies ist die statistisch abgeleitete einfache Dosis einer Substanz, die bei
oraler Verabreichung bei 50 % der Tiere zum Tod führen kann. Der LD50 -Wert wird in lg Prüfsubstanz je
Biene angegeben. Bei Pflanzenschutzmitteln kann die Prüfsubstanz entweder als Wirkstoff oder als formuliertes
Produkt mit einem oder mehreren Wirkstoffen vorliegen.
Mortalität: Ein Tier wird als tot protokolliert, wenn es absolut unbeweglich ist.
1.3. PRINZIP DER METHODE
Erwachsene Arbeitshonigbienen (Apis mellifera) werden einem Bereich von Dosen der in einer Zuckerlösung
dispergierten Prüfsubstanz ausgesetzt. Die Bienen werden dann mit derselben Lösung, jedoch ohne die Prüfsub-
stanz, gefüttert. Die Mortalität wird täglich im Verlauf von zumindest 48 Stunden protokolliert und mit Kon-
trollwerten verglichen. Wenn die Mortalitätsrate in der Zeit zwischen 24 Stunden und 48 Stunden zunimmt,
während die Kontrollmortalität auf einem akzeptierten Stand bleibt, d. h. Ä 10 % , ist es angebracht, die Dauer
der Prüfung auf maximal 96 Stunden zu verlängern. Die Ergebnisse werden ausgewertet, um die LD50 für 24
Stunden und 48 Stunden und, sofern die Untersuchung verlängert wurde, für 72 Stunden und 96 Stunden zu
berechnen.
1.4. VALIDITÄTSKRITERIEN
Damit die Validität einer Prüfung gegeben ist, gelten die folgenden Bedingungen:
Š Die durchschnittliche Mortalität darf bei der gesamten Anzahl an Kontrollen 10 % am Ende der Prüfung
nicht übersteigen;
Š die LD50 der toxischen Bezugsnormale entspricht dem festgelegten Bereich.
1.5. BESCHREIBUNG DER METHODE
1.5.1. Sammlung der Bienen
Es sollten junge erwachsene Arbeiterinnen derselben Rasse verwendet werden, d. h. Bienen gleichen Alters,
gleichen Ernährungszustands usw. Die Bienen sollten aus angemessen gefütterten, gesunden, möglichst krank-
heitsfreien Völkern mit Königin stammen, deren Vorgeschichte und physiologischer Zustand bekannt ist. Sie

könnten am Morgen der Verwendung oder am Abend vor der Prüfung gesammelt und bis zum nächsten Tag
unter Prüfbedingungen gehalten werden. Bienen, die von Rähmchen ohne Brut gesammelt werden, sind geeig-
net. Eine Sammlung im frühen Frühjahr oder Spätherbst sollte vermieden werden, da die Bienen in dieser Zeit
eine veränderte Physiologie aufweisen. Müssen Prüfungen im frühen Frühjahr oder Spätherbst durchgeführt
werden, können Bienen in einem Brutschrank zum Schlüpfen gebracht und eine Woche lang mit —i.Bienenbrot—
(aus der Wabe gesammelte Pollen) und Zuckerlösung aufgezogen werden. Bienen, die mit chemischen Substan-
zen behandelt wurden, wie z. B. Antibiotika, Anti-Varroa-Produkten usw., sollten nach dem Ende der letzten
Behandlung vier Wochen nicht für Toxizitätsprüfungen eingesetzt werden.in
1.5.2. Unterbringungs- und Fütterungsbedingungen
Verwendet werden einfach zu säubernde und gut belüftete Käfige. Dabei kann jedes geeignete Material verwen-
det werden, beispielsweise Edelstahl-, Drahtgitter-, Kunststoff- oder Einwegholzkäfige usw. Es sollten möglichst
Gruppen von jeweils zehn Bienen pro Käfig zum Einsatz kommen. Die Größe der Prüfkäfige sollte der Anzahl
der Bienen entsprechen, d. h. angemessenen Platz bieten.
Die Bienen sollten im Dunkeln in einem Versuchsraum mit einer Temperatur von 25 °C ± 2 °C gehalten wer-
den. Die relative Feuchte, die im Normalfall zwischen 50 und 70 % liegt, sollte während der gesamten Prüfung
gemessen und protokolliert werden. Alle Tätigkeiten, einschließlich Behandlung und Beobachtungen, können
bei (Tages-) Licht durchgeführt werden. Als Futter wird eine Zuckerlösung in Wasser mit einer endgültigen
Konzentration von 500 g/l (50 % Gew./Vol.) verwendet. Nach Verabreichung der Prüfdosen sollte das Futter
nach Belieben dargeboten werden. Das Fütterungssystem sollte die Möglichkeit bieten, die Futteraufnahme für
jeden Käfig zu protokollieren (siehe 1.6.3.1). Es kann ein Glasröhrchen (circa 50 mm lang und 10 mm breit
und am offenen Ende auf einen Durchmesser von etwa 2 mm verjüngt) verwendet werden.
1.5.3. Vorbereitung der Bienen
Die gesammelten Bienen werden nach dem Zufallsprinzip auf die Prüfkäfige verteilt, die ebenfalls zufällig in
dem Versuchsraum angeordnet sind.
Vor Beginn der Prüfung kann man die Bienen bis zu 2 Stunden hungern lassen. Es wird empfohlen, den Bie-
nen vor der Behandlung die Nahrung zu entziehen, damit der Darminhalt zu Beginn der Prüfung bei allen Bie-
nen gleich ist. Im Sterben liegende Bienen sollten ausgesondert und vor Beginn der Prüfung durch gesunde
Bienen ersetzt werden.
1.5.4. Herstellung der Dosen
Sofern es sich bei der Prüfsubstanz um eine mit Wasser mischbare Verbindung handelt, kann diese direkt in
einer 50%igen Zuckerlösung dispergiert werden. Bei technischen Produkten und Substanzen mit geringer Was-
serlöslichkeit können Trägersubstanzen wie organische Lösemittel, Emulgatoren oder Dispersionsmittel mit
geringer Bienentoxizität verwendet werden (z. B. Aceton, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid). Die Konzen-
tration des Trägers hängt dabei von der Löslichkeit der Prüfsubstanz ab und sollte für alle geprüften Konzen-
trationen gleich sein. Im allgemeinen ist eine Konzentration der Trägersubstanz von 1 % angemessen und
sollte nicht überschritten werden.
Es sollten entsprechende Kontrollösungen hergestellt werden, d. h., wird ein Löse- oder Dispersionsmittel zur
Lösung der Prüfsubstanz benutzt, sollten zwei getrennte Kontrollgruppen verwendet werden, und zwar eine
Lösung in Wasser und eine Zuckerlösung mit dem Lösemittel/Träger in der Konzentration, die auch in den
Dosierlösungen vorliegt.
1.6. VORGEHENSWEISE
1.6.1. Prüf- und Kontrollgruppen
Die Anzahl an geprüften Dosen und Wiederholungen sollte die statistischen Anforderungen für eine Bestim-
mung der LD50 mit einem 95%igen Vertrauensbereich erfüllen. Im Normalfall sind für die Prüfung fünf Dosen
in einer geometrischen Reihe, die sich um einen Faktor von nicht mehr als 2,2 unterscheiden und den Bereich
für die LD50 , abdecken, erforderlich. Der Verdünnungsfaktor und die Anzahl an Konzentrationen für die
Dosierung müssen jedoch im Verhältnis zur Steigung der Toxizitätskurve (Dosis im Verhältnis zu Mortalität)
unter Berücksichtigung der für die Auswertung der Ergebnisse herangezogenen statistischen Methode bestimmt
werden. Mit Hilfe einer Vorprüfung zur Bestimmung des Konzentrationsbereichs lassen sich die angemessenen
Konzentrationen für die Dosierung auswählen.
Mindestens drei Wiederholungsprüfgruppen von jeweils zehn Bienen sollten jeder Prüfkonzentrationsdosis aus-
gesetzt werden. Zusätzlich zu den Prüfreihen sollten mindestens drei Kontrollgruppen von jeweils zehn Bienen
zum Einsatz kommen. Kontrollgruppen sollten auch für die verwendeten Lösemittel/Trägersubstanzen einbezo-
gen werden (siehe 1.5.4).
1.6.2. Toxischer Standard
In die Prüfreihen ist ein toxischer Standard aufzunehmen. Zumindest drei Dosen sollten ausgewählt werden,
die den erwarteten LD50 -Wert abdecken. Für jede Prüfdosis sollten mindestens drei Wiederholungskäfige mit
jeweils zehn Bienen verwendet werden Der bevorzugte toxische Standard ist Dimethoat; für diesen Stoff liegt
die nachgewiesene orale LD50 für 24 Stunden im Bereich von 0,10 bis 0,35 lg Wirkstoff/Biene (2). Andere
toxische Standards wären jedoch annehmbar, soweit hinreichende Daten zur Überprüfung der erwarteten
Dosisreaktion vorgelegt werden können (z. B. Parathion).

1.6.3. Exposition
1.6.3.1. Verabreichung der Dosen
Jeder Prüfgruppe von Bienen müssen 100 bis 200 ll einer 50 %igen Zuckerlösung in Wasser mit der Prüfsub-
stanz in der entsprechenden Konzentration verabreicht werden. Bei Produkten mit geringer Löslichkeit, nied-
riger Toxizität oder geringer Konzentration in der Rezeptur ist ein größeres Volumen erforderlich, da dann
größere Anteile an Zuckerlösung verwendet werden müssen. Die Menge an aufgenommener Nahrung je
Gruppe ist festzuhalten. Nach dem Verzehr (im allgemeinen innerhalb von 3 bis 4 Stunden) muss die Fütte-
rungsvorrichtung aus dem Käfig entfernt und durch eine Vorrichtung, die ausschließlich Zuckerlösung enthält,
ersetzt werden. Die Zuckerlösung wird dann nach Belieben dargeboten. Bei einigen Verbindungen kann bei
höheren Konzentrationen die Ablehnung der Prüfdosis dazu führen, dass nur wenig oder gar kein Futter auf-
genommen wird. Nach maximal 6 Stunden sollte das bis dahin unverbrauchte behandelte Futter durch eine
reine Zuckerlösung ersetzt werden. Die Menge an aufgenommenem behandeltem Futter muss gemessen wer-
den (z. B. Messung von Volumen/Gewicht des noch verbleibenden behandelten Futters).
1.6.3.2. Dauer
Die Dauer der Prüfung sollte vorzugsweise 48 Stunden ab dem Zeitpunkt, zu dem die Prüflösung durch die
Zuckerlösung allein ersetzt wurde, betragen. Steigt die Mortalität nach den ersten 24 Stunden weiterhin um
mehr als 10 % an, sollte die Prüfdauer auf maximal 96 Stunden verlängert werden, sofern die Kontrollmortali-
tät nicht über 10 % hinausgeht.
1.6.4. Beobachtungen
Die Mortalität wird 4 Stunden nach Beginn der Prüfung und dann nach 24 Stunden und 48 Stunden protokol-
liert (d. h. nach Verabreichung der Dosis). Ist ein verlängerter Beobachtungszeitraum erforderlich, sollten wei-
tere Bewertungen im Abstand von 24 Stunden bis maximal 96 Stunden vorgenommen werden, sofern die
Kontrollmortalität 10 % nicht übersteigt.
Die Menge an aufgenommenem Futter pro Gruppe muß gemessen werden. Ein Vergleich zwischen den Antei-
len an verzehrtem behandeltem und unbehandeltem Futter innerhalb der vorgegebenen 6 Stunden kann Auf-
schluss über die Genießbarkeit des behandelten Futters geben.
Alle anormalen Verhaltensweisen während des Prüfzeitraums müssen protokolliert werden.
1.6.5. Limit-Test
In einigen Fällen (z. B. wenn man erwartet, dass die Prüfsubstanz eine geringe Toxizität besitzt) kann ein
Limit-Test mit 100 lg Wirkstoff/Biene durchgeführt werden, um nachzuweisen, dass die LD50 höher als dieser
Wert ist. Dabei sollte das gleiche Verfahren zum Einsatz kommen, einschließlich drei Wiederholungsprüfgrup-
pen für die Prüfdosis, die betreffenden Kontrollen, die Messung der Menge an verzehrtem behandeltem Futter
und die Verwendung des toxischen Standards. Sofern Mortalitäten auftreten, sollte eine vollständige Unter-
suchung durchgeführt werden. Eventuell beobachtete subletale Wirkungen (siehe 1.6.4) müssen dokumentiert
werden.
2. DATEN UND BERICHTERSTATTUNG
2.1. DATEN
Daten sollten in tabellarischer Form zusammengefasst werden, wobei für jede Behandlungsgruppe sowie für
die Kontrollgruppe und die Gruppe mit dem toxischen Standard die Anzahl an eingesetzten Bienen, die Morta-
lität für jede Beobachtungszeit und die Anzahl an Bienen mit beeinträchtigtem Verhalten auszuweisen sind.
Die Mortalitätsdaten sind mit angemessenen statistischen Verfahren zu analysieren (z. B. Probit-Analyse, glei-
tender Durchschnitt, binomiale Wahrscheinlichkeit) (3) (4). Die Dosisreaktionskurven sind für jede empfohlene
Beobachtungszeit darzustellen, und die Steigungen der Kurven und die mittleren letalen Dosen (LD50 ) sind mit
einem 95 % Vertrauensbereich zu berechnen. Korrekturen an der Kontrollmortalität könnten mit Hilfe der
Abbottschen Korrektur vorgenommen werden (4) (5). Sofern das behandelte Futter nicht vollständig verzehrt
wurde, sollte die Prüfsubstanzdosis, die von jeder Gruppe aufgenommen wurde, ermittelt werden. Die LD50
sollte in lg Prüfsubstanz je Biene angegeben werden.
2.2. PRÜFBERICHT
Der Prüfbericht muss die folgenden Angaben enthalten:
2.2.1. Prüfsubstanz
Š Physikalische Beschaffenheit und relevante physikalisch-chemische Eigenschaften (z. B. Stabilität in Wasser,
Dampfdruck);
Š Daten zur chemischen Identifikation, einschließlich Strukturformel, Reinheit (d. h., für Pflanzenschutzmit-
tel die Identität und Konzentration des/der Wirkstoffs(e).

2.2.2. Geprüfte Bienenart
Š Wissenschaftlicher Name, Rasse, ungefähres Alter (in Wochen), Sammlungsverfahren, Datum der Samm-
lung;
Š Angaben über die Völker, die für die Sammlung der Prüfbienen eingesetzt wurden, einschließlich Gesund-
heitszustand, eventuelle Krankheiten von erwachsenen Bienen, eventuelle Vorbehandlungen usw.
2.2.3. Prüfbedingungen
Š Temperatur und relative Feuchte des Versuchsraums;
Š Unterbringungsbedingungen einschließlich Art, Größe und Material der Käfige;
Š Verfahren für die Herstellung der Stamm- und Prüflösungen (sofern ein Lösemittel verwendet wird, müs-
sen dieses Mittel und seine Konzentration angegeben werden);
Š Versuchsanlage, z. B. Anzahl und eingesetzte Prüfkonzentrationen, Anzahl an Kontrollen; für jede Prüf-
konzentration und Kontrolle Anzahl an Wiederholungskäfigen und Anzahl an Bienen pro Käfig;
Š Datum der Prüfung.
2.2.4. Ergebnisse
Š Ergebnisse von eventuellen Vorversuchen zur Ermittlung des Konzentrationsbereichs;
Š Rohdaten: Mortalität bei jeder geprüften Dosis zu jeder Beobachtungszeit;
Š Darstellung der Dosisreaktionskurven am Ende der Prüfung;
Š LD50 -Werte mit 95%igem Vertrauensbereich für jede empfohlene Beobachtungszeit, jede Prüfsubstanz und
den toxischen Standard;
Š zur Bestimmung der LD50 herangezogene statistische Verfahren;
Š Mortalität in Kontrollen;
Š sonstige beobachtete oder gemessene biologische Wirkungen, z. B. abnormes Verhalten der Bienen (ein-
schließlich Ablehnung der Prüfdosis), Anteil an verzehrtem Futter in behandelten und unbehandelten
Gruppen;
Š eventuelle Abweichungen von den hier beschriebenen Prüfverfahren und sonstige relevante Informationen.
3. LITERATURHINWEISE
(1) EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant
Protection Products Š Honeybees. EPPO Bulletin, Vol. 23, N.1, pp. 151-165. March 1993.
(2) Gough, H. J., McIndoe, E.C., Lewis, G.B. (1994). The use of dimethoate as a reference compound in
laboratory acute toxicity tests on honeybees (Apis mellifera L.) 1981-1992. Journal of Apicultural Research,
22, pp. 119-125.
(3) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour.
Pharmacol. and Exper. Ther., 96, pp. 99-113.
(4) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New York.
(5) Abbott, W. S. (1925). A method for computing the effectiveness of an insecticide. Jour. Econ. Entomol.,
18, pp. 265-267.

C.17. HONIGBIENEN Š AKUTE KONTAKTTOXIZITÄTSPRÜFUNG
1. METHODE
Diese Methode zur Prüfung der akuten Toxizität entspricht der OECD TG 214 (1998).
1.1. EINLEITUNG
Diese Toxizitätsprüfung ist ein Laborverfahren, mit dem die akute Kontakttoxizität von Pflanzenschutzmitteln
und anderen Chemikalien für erwachsene Arbeitshonigbienen bewertet werden soll.
Bei der Bewertung und Beurteilung der toxischen Merkmale von Substanzen ist unter Umständen die Bestim-
mung der akuten Kontakttoxizität bei Bienen erforderlich, beispielsweise wenn die Wahrscheinlichkeit einer
Exposition von Bienen gegenüber einer bestimmten Chemikalie besteht. Die akute Kontakttoxizitätsprüfung
wird durchgeführt, um die spezifische Toxizität von Pestiziden und anderen Chemikalien für Bienen zu bestim-
men. Die Ergebnisse dieser Prüfung sollten herangezogen werden, um festzulegen, ob weiterer Beurteilungs-
bedarf besteht. Diese Methode kann insbesondere in schrittweise aufgebauten Programmen zur Bewertung der
Gefahren von Pflanzenschutzmittel für Bienen verwendet werden, die auf einem sequenziellen Übergang von
Labortoxizitätsprüfungen auf Halbfreiland- und Freilandversuche beruhen (1). Pestizide können dabei als Wirk-
stoffe oder als formulierte Produkte geprüft werden.
Zur Überprüfung der Empfindlichkeit der Bienen und der Genauigkeit des Prüfverfahrens sollte ein toxischer
Standard verwendet werden.
1.2. BEGRIFFSBESTIMMUNGEN
Akute Kontakttoxizität: Dies sind die negativen Wirkungen, die innerhalb eines Zeitraums von maximal 96
Stunden bei einer topikalen Verabreichung einer einzelnen Dosis der Prüfsubstanz auftreten.
Dosis: Dies ist die aufgebrachte Menge an Prüfsubstanz. Die Dosis wird als Menge (lg) Prüfsubstanz je Prüftier
angegeben (lg/Biene).
Kontakt-LD50 (mittlere letale Dosis): Dies ist die statistisch abgeleitete einzelne Dosis einer Substanz, die bei
Verabreichung durch Kontakt bei 50 % der Tiere zum Tod führen kann. Der LD50 -Wert wird in lg Prüfsub-
stanz je Biene angegeben. Bei Pestiziden kann die Pflanzenschutzmitteln entweder als Wirkstoff oder als for-
muliertes Produkt mit einem oder mehreren Wirkstoffen vorliegen.
Mortalität: Ein Tier wird als tot protokolliert, wenn es absolut unbeweglich ist.
1.3. PRINZIP DER METHODE
Erwachsene Arbeitshonigbienen (Apis mellifera) werden einem Bereich von Dosen der in einem entsprechen-
den Träger gelösten Prüfsubstanz durch direktes Aufbringen auf den Thorax (Tröpfchen) ausgesetzt. Die Dauer
der Prüfung beträgt 48 Stunden. Wenn die Mortalitätsrate in der Zeit zwischen 24 Stunden und 48 Stunden
zunimmt, während die Kontrollmortalität auf einem akzeptierten Stand bleibt, d. h. Ä 10 % , ist es angebracht,
die Dauer der Prüfung auf maximal 96 Stunden zu verlängern. Die Mortalität wird täglich protokolliert und
mit Kontrollwerten verglichen. Die Ergebnisse werden ausgewertet, um die LD50 für 24 Stunden und 48 Stun-
den und, sofern die Untersuchung verlängert wurde, für 72 Stunden und 96 Stunden zu berechnen.
1.4. VALIDITÄTSKRITERIEN
Damit die Validität einer Prüfung gegeben ist, gelten die folgenden Bedingungen:
Š Die durchschnittliche Mortalität darf bei der gesamten Anzahl an Kontrollen 10 % am Ende der Prüfung
nicht übersteigen;
Š die LD50 des toxischen Standards entspricht dem festgelegten Bereich.
1.5. BESCHREIBUNG DER METHODE
1.5.1. Sammlung der Bienen
Es sollten junge erwachsene Arbeiterinnen verwendet werden, d. h., Bienen gleichen Alters, gleichen Ernäh-
rungszustands, gleicher Rasse usw. Die Bienen sollten aus angemessen gefütterten, gesunden, möglichst krank-
heitsfreien Völkern mit Königin stammen, deren Vorgeschichte und physiologischer Zustand bekannt ist. Sie

könnten am Morgen der Verwendung oder am Abend vor der Prüfung gesammelt und bis zum nächsten Tag
unter Prüfbedingungen gehalten werden. Bienen, die von Rähmchen ohne Brut gesammelt werden, sind geeig-
net. Eine Sammlung im frühen Frühjahr oder Spätherbst sollte vermieden werden, da die Bienen in dieser Zeit
eine veränderte Physiologie aufweisen. Müssen Prüfungen im frühen Frühjahr oder Spätherbst durchgeführt
werden, können Bienen in einem Brutschrank zum Schlüpfen gebracht und eine Woche lang mit —Bienenbrotih
(aus der Wabe gesammelte Pollen) und Zuckerlösung aufgezogen werden. Bienen, die mit chemischen Substan-
zen behandelt wurden wie z. B. Antibiotika, Anti-Varroa-Produkten usw., sollten nach dem Ende der letzten
Behandlung vier Wochen nicht für Toxizitätsprüfungen eingesetzt werden.
1.5.2. Unterbringungs- und Fütterungsbedingungen
Verwendet werden einfach zu säubernde und gut belüftete Käfige. Dabei kann jedes geeignete Material benutzt
werden, beispielsweise Edelstahl-, Drahtgitter-, Kunststoff- oder Einwegholzkäfige, usw. Die Größe der Prüfkä-
fige sollte der Anzahl der Bienen entsprechen, d. h. angemessenen Platz bieten. Es sollten möglichst Gruppen
von jeweils zehn Bienen pro Käfig zum Einsatz kommen.
Die Bienen sollten im Dunkeln in einem Versuchsraum mit einer Temperatur von 25 ± 2 °C gehalten werden.
Die relative Feuchte, die im Normalfall zwischen 50 und 70 % liegt, sollte während der gesamten Prüfung
gemessen und protokolliert werden. Alle Tätigkeiten, einschließlich Behandlung und Beobachtungen, können
bei (Tages-) Licht durchgeführt werden. Als Futter sollte eine Zuckerlösung in Wasser mit einer endgültigen
Konzentration von 500 g/l (50 % Gew./Vol.) verwendet und nach Belieben während der Prüfdauer mit Hilfe
einer Bienenfütterungsvorrichtung dargeboten werden. Dies kann ein Glasröhrchen (circa 50 mm lang und 10
mm breit und am offenen Ende auf einen Durchmesser von etwa 2 mm verjüngt) sein.
1.5.3. Vorbereitung der Bienen
Die gesammelten Bienen können mit Kohlendioxid oder Stickstoff zum Aufbringen der Prüfsubstanz betäubt
werden. Dabei sollten die Menge an Betäubungsmittel und dessen Einwirkungszeit so gering wie möglich
gehalten werden. Im Sterben liegende Bienen sollten ausgesondert und vor Beginn der Prüfung durch gesunde
Bienen ersetzt werden.
1.5.4. Herstellung der Dosen
Die Prüfsubstanz ist als Lösung in einer Trägersubstanz aufzubringen, d. h. einem organischen Lösemittel oder
einer Wasserlösung mit einem Benetzungsmittel. Als organisches Lösemittel wird Aceton bevorzugt, aber auch
andere organische Lösemittel mit geringer Bienentoxizität können verwendet werden (z. B. Dimethylformamid,
Dimethylsulfoxid). Bei in Wasser dispergierten formulierten Produkten und hochpolaren organischen Substan-
zen, die in organischen Trägerlösemitteln nicht löslich sind, lassen sich die Lösungen unter Umständen ein-
facher auftragen, wenn sie in einer schwachen Lösung eines handelsüblichen Benetzungsmittels hergestellt wer-
den (z. B. Agral, Cittowett, Lubrol, Triton, Tween).
Es sollten entsprechende Kontrollösungen hergestellt werden, d. h., wird ein Löse- oder Dispersionsmittel zur
Lösung der Prüfsubstanz benutzt, sollten zwei getrennte Kontrollgruppen verwendet werden, und zwar eine,
die mit Wasser, und eine, die mit dem Löse-/Dispersionsmittel behandelt ist.
1.6. VORGEHENSWEISE
1.6.1. Prüf- und Kontrollgruppen
Die Anzahl an geprüften Dosen und Wiederholungen sollte die statistischen Anforderungen für eine Bestim-
mung der LD50 mit einem 95%igen Vertrauensbereich erfüllen. Im Normalfall sind für die Prüfung fünf Dosen
in einer geometrischen Reihe, die sich um einen Faktor von nicht mehr als 2,2 unterscheiden und den Bereich
für die LD50 , abdecken, erforderlich. Die Anzahl an Dosen muß jedoch im Verhältnis zur Steigung der Toxizi-
tätskurve (Dosis im Verhältnis zu Mortalität) unter Berücksichtigung der für die Auswertung der Ergebnisse
herangezogenen statistischen Methode bestimmt werden. Mit Hilfe einer Vorprüfung zur Bestimmung des Kon-
zentrationsbereichs lassen sich die angemessenen Dosen auswählen.
Mindestens drei Wiederholungsprüfgruppen von jeweils zehn Bienen sollten jeder Prüfkonzentrationsdosis aus-
gesetzt werden.
Zusätzlich zu den Prüfreihen sollten mindestens drei Kontrollgruppen von jeweils zehn Bienen zum Einsatz
kommen. Wird ein organisches Lösemittel oder ein Benetzungsmittel verwendet, müssen drei zusätzliche Kon-
trollgruppen mit jeweils zehn Bienen für das Löse- oder Benetzungsmittel mit einbezogen werden.
1.6.2. Toxischer Standard
In die Prüfreihen ist ein toxischer Standard aufzunehmen. Zumindest drei Dosen sollten ausgewählt werden,
die den erwarteten LD50 -Wert abdecken. Für jede Prüfdosis sollten mindestens drei Wiederholungskäfige mit
jeweils zehn Bienen verwendet werden. Der bevorzugte toxische Standard ist Dimethoat; für diesen Stoff liegt
die nachgewiesene Kontakt-LD50 für 24 Stunden im Bereich von 0,10 bis 0,30 lg Wirkstoff/Biene (2). Andere
toxische Standards wären jedoch annehmbar, soweit hinreichende Daten zur Überprüfung der erwarteten
Dosisreaktion vorgelegt werden können (z. B. Parathion).

1.6.3. Exposition
1.6.3.1. Verabreichung der Dosen
Bei den betäubten Bienen erfolgt jeweils einzeln eine topikale Aufbringung. Die Bienen werden nach dem
Zufallsprinzip den verschiedenen Prüfdosen und Kontrollen zugeordnet. Ein Volumen von 1 ll Lösung mit der
Prüfsubstanz in der geeigneten Konzentration wird mit einem Mikroapplikator auf die Dorsalseite des Thorax
einer jeden Biene aufgetragen. Sofern begründet, können andere Volumina verwendet werden. Nach dem Auf-
tragen werden die Bienen auf die Prüfkäfige verteilt und mit den Zuckerlösungen versorgt.
1.6.3.2. Dauer
Die Dauer der Prüfung sollte vorzugsweise 48 Stunden betragen. Steigt die Mortalität zwischen 24 und 48
Stunden um mehr als 10 % an, sollte die Prüfdauer auf maximal 96 Stunden verlängert werden, sofern die
Kontrollmortalität nicht über 10 % hinausgeht.
1.6.4. Beobachtungen
Die Mortalität wird 4 Stunden nach der Dosierung und dann nach 24 Stunden und 48 Stunden protokolliert.
Ist ein verlängerter Beobachtungszeitraum erforderlich, sollten weitere Bewertungen im Abstand von 24 Stun-
den bis maximal 96 Stunden vorgenommen werden, sofern die Kontrollmortalität 10 % nicht übersteigt.
Alle anormalen Verhaltensweisen während des Prüfzeitraums müssen protokolliert werden.
1.6.5. Limit-Test
In einigen Fällen (z. B. wenn man erwartet, daß die Prüfsubstanz eine geringe Toxizität besitzt) kann ein Limit-
Test mit 100 lg Wirkstoff/Biene durchgeführt werden, um nachzuweisen, daß die LD50 höher als dieser Wert
ist. Dabei sollte das gleiche Verfahren zum Einsatz kommen, einschließlich drei Wiederholungsprüfgruppen
für die Prüfdosis, die betreffenden Kontrollen und die Verwendung des toxischen Standards. Sofern Mortalitä-
ten auftreten, sollte eine vollständige Untersuchung durchgeführt werden. Eventuell beobachtete subletale Wir-
kungen (siehe 1.6.4) sind zu dokumentieren.
2. DATEN UND BERICHTERSTATTUNG
2.1. DATEN
Daten sollten in tabellarischer Form zusammengefasst werden, wobei für jede Behandlungsgruppe sowie für
die Kontrollgruppe und die Gruppe mit dem toxischen Standard die Anzahl an eingesetzten Bienen, die Morta-
lität für jede Beobachtungszeit und die Anzahl an Bienen mit beeinträchtigtem Verhalten auszuweisen sind.
Die Mortalitätsdaten sind mit angemessenen statistischen Verfahren zu analysieren (z. B. Probit-Analyse, glei-
tender Durchschnitt, binomiale Wahrscheinlichkeit) (3) (4). Die Dosisreaktionskurven sind für jede empfohlene
Beobachtungszeit (d. h. 24 und 48 Stunden sowie, soweit zutreffend, 72 und 96 Stunden) darzustellen, und
die Steigungen der Kurven und die mittleren letalen Dosen (LD50 ) sind mit einem 95 % Vertrauensbereich zu
berechnen. Korrekturen um die Kontrollmortalität könnten mit Hilfe der Abbottschen Korrektur vorgenom-
men werden (4) (5). Die LD50 sollte in lg Prüfsubstanz je Biene angegeben werden.
2.2. PRÜFBERICHT
Der Prüfbericht muss die folgenden Angaben enthalten:
2.2.1. Prüfsubstanz
Š Physikalische Beschaffenheit und relevante physikalisch-chemische Eigenschaften (z. B. Stabilität in Wasser,
Dampfdruck);
Š Daten zur chemischen Identifikation, einschließlich Strukturformel, Reinheit (d. h. für Pflanzenschutzmittel
die Identität und Konzentration des bzw. der Wirkstoffe).
2.2.2. Geprüfte Bienenart
Š Wissenschaftlicher Name, Rasse, ungefähres Alter (in Wochen), Sammlungsverfahren, Datum der Samm-
lung;
Š Angaben über die Völker, die für die Sammlung der Prüfbienen eingesetzt wurden, einschließlich Gesund-
heitszustand, eventuelle Krankheiten von erwachsenen Bienen, eventuelle Vorbehandlungen usw.

2.2.3. Prüfbedingungen
Š Temperatur und relative Feuchte des Versuchsraums;
Š Unterbringungsbedingungen einschließlich Art, Größe und Material der Käfige;
Š Verfahren für die Verabreichung der Prüfsubstanz, z. B. verwendete Trägerlösung, aufgebrachtes Prüf-
lösungsvolumen, verwendetes Betäubungsmittel;
Š Versuchsanlage, z. B. Anzahl und eingesetzte Prüfdosen, Anzahl an Kontrollen; für jede Prüfdosis und
Kontrolle Anzahl an Wiederholungskäfigen und Anzahl an Bienen pro Käfig;
Š Datum der Prüfung.
2.2.4. Ergebnisse
Š Ergebnisse von eventuellen Vorversuchen zur Ermittlung des Konzentrationsbereichs;
Š Rohdaten: Mortalität bei jeder geprüften Konzentration zu jeder Beobachtungszeit;
Š Darstellung der Dosisreaktionskurven am Ende der Prüfung;
Š LD50 -Werte mit 95%igem Vertrauensbereich für jede empfohlene Beobachtungszeit, jede Prüfsubstanz und
den toxischen Standard;
Š zur Bestimmung der LD50 herangezogene statistische Verfahren;
Š Mortalität in Kontrollen;
Š sonstige beobachtete oder gemessene biologische Wirkungen und eventuelle abnorme Reaktionen der Bie-
nen;
Š eventuelle Abweichungen von den hier beschriebenen Prüfverfahren und sonstige relevante Informationen.
3. LITERATURHINWEISE
(1) EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant
Protection Products Š Honeybees. EPPO bulletin, Vol. 23, N.1, pp. 151-165. March 1993.
(2) Gough, H. J., McIndoe, E. C., Lewis, G. B. (1994). The use of dimethoate as a reference compound in
laboratory acute toxicity tests on honeybees (Apis mellifera L.), 1981-1992. Journal of Apicultural Research
22, pp. 119-125.
(3) Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour.
Pharmacol. and Exper. Ther., 96, pp. 99-113.
(4) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New York.
(5) Abbott, W. S. (1925). A method for computing the effectiveness of an insecticide. Jour. Econ. Entomol.
18, pp. 265-267.

C.18. ADSORPTION/DESORPTION NACH EINER SCHÜTTELMETHODE
1. METHODE
Diese Methode ist ein Verfahren im Format der Prüfrichtlinie OECD TG 106 zur Bestimmung von Boden-
adsorption bzw. -desorption nach einer Schüttelmethode (Batch Equilibrium Method) (2000).
1.1. EINLEITUNG
Die Methode stützt sich auf einen Ringtest und einen Workshop zur Bodenauswahl für die Entwicklung eines
Adsorptionstests (1) (2) (3) (4) sowie auf einzelstaatliche Leitlinien (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11).
Anhand von Adsorptions-/Desorptionsuntersuchungen lassen sich wesentliche Informationen über die Mobili-
tät von Chemikalien und deren Verteilung in den Boden-, Wasser- und Luftkompartimenten der Biosphäre
gewinnen (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21). Diese Informationen können bei der Vorhersage
bzw. Abschätzung beispielsweise der Verfügbarkeit einer Chemikalie für den Abbau (22) (23), die Umwand-
lung und die Aufnahme durch Organismen (24) Auswaschung durch das Bodenprofil (16) (18) (19) (21) (25)
(26) (27) (28); Volatilität aus dem Boden (21) (29) (30); oberflächliches Abfließen in natürliche Gewässer (18)
(31) (32) herangezogen werden. Adsorptionsdaten eignen sich für Vergleichs- und Modellierungszwecke (19)
(33) (34) (35).
Die Verteilung einer Chemikalie zwischen der Boden- und Wasserphase ist ein komplexer Prozess und von
einer Reihe unterschiedlicher Faktoren abhängig: der chemischen Beschaffenheit der Substanz (12) (36) (37)
(38) (39) (40), den Merkmalen des Bodens (4) (12) (13) (14) (41) (42) (43) (44) (45) (46) (47) (48) (49) sowie
klimatischen Faktoren wie Niederschlag, Temperatur, Sonnenlicht und Wind. Folglich ist es nicht möglich, die
zahlreichen Phänomene und Mechanismen, die am Prozess der Adsorption einer Chemikalie durch den Boden
beteiligt sind, vollständig durch ein vereinfachtes Labormodell wie die vorliegende Methode zu definieren.
Doch auch wenn dieser Versuch nicht alle in der Umwelt möglichen Fälle berücksichtigen kann, liefert er doch
ausreichende Informationen zur Umweltrelevanz der Adsorption einer Chemikalie.
Siehe auch Allgemeine Einleitung.
1.2. ANWENDUNGSBEREICH
Das Verfahren dient der Abschätzung des Adsorptions-/Desorptionsverhaltens einer Substanz an Böden. Das
Ziel besteht darin, einen Sorptionswert zu erhalten, der zur Prognose der Verteilung unter den verschiedensten
Umweltbedingungen benutzt werden kann; zu diesem Zweck werden für eine Chemikalie an verschiedenen
Böden Gleichgewichtsadsorptionskoeffizienten als Funktion von Bodenmerkmalen (z. B. organischer Kohlen-
stoffgehalt, Tongehalt sowie Bodentextur und pH-Wert) bestimmt. Um die Interaktionen einer bestimmten
Substanz mit natürlich vorkommenden Böden weitestmöglich zu erfassen, sind unterschiedliche Bodentypen
zu verwenden.
Bei dieser Methode steht Adsorption für den Prozeß des Anlagerns einer Chemikalie an Bodenoberflächen; es
erfolgt keine Unterscheidung zwischen unterschiedlichen Adsorptionsprozessen (physikalische und chemische
Adsorption) und solchen Prozessen wie oberflächenkatalysierter Abbau, Volumenadsorption oder chemische
Reaktion. Nicht berücksichtigt ist die Adsorption an von den Böden erzeugte kolloide Partikel (Durchmesser
< 0,2 lm),
Folgenden Bodenparametern wird in bezug auf die Adsorption der größte Stellenwert beigemessen: dem orga-
nischen Kohlenstoffgehalt (3) (4) (12) (13) (14) (41) (43) (44) (45) (46) (47) (48), dem Tongehalt und der
Bodentextur (3) (4) (41) (42) (43) (44) (45) (46) (47) (48) sowie für ionisierbare Verbindungen dem pH-Wert
(3) (4) (42). Weitere Bodenparameter, die einen Einfluss auf die Adsorption-Desorption einer Substanz haben,
sind die effektiven Kationenaustauschkapazität (KAKeff ), der Gehalt an amorphen Eisen- und Aluminiumoxiden,
insbesondere für vulkanische und tropische Böden (4), wie auch die spezifische Oberfläche (49).
Der Test ist dafür ausgelegt, die Adsorption einer Chemikalie an unterschiedliche Bodentypen mit einer Reihe
unterschiedlicher organischer Kohlenstoffgehalte, Tongehalte und Bodentexturen sowie pH-Werte zu bewerten.
Er besteht aus drei Stufen:
Stufe 1: Voruntersuchung zur Bestimmung:
Š des Boden-Lösungs-Verhältnisses;
Š der Gleichgewichtszeit für die Adsorption und der bei Gleichgewicht adsorbierten Menge an
Testsubstanz;
Š der Adsorption der Testsubstanz an der Oberfläche der Testgefäße und der Stabilität der Test-
substanz während des Testzeitraums.
Stufe 2: Screening-Test: Bei fünf verschiedenen Bodentypen wird die Adsorption anhand der Adsorptions-
kinetik bei einer einzigen Konzentration und mittels Bestimmung des Verteilungskoeffizienten Kd
und Koc untersucht.

Stufe 3: Bestimmung von Freundlich-Adsorptionsisothermen zur Ermittlung des Einflusses der Konzentration
auf die Adsorption an Böden.
Untersuchung der Desorption mit Hilfe von Desorptionskinetik/Freundlich-Desorptionsisothermen
(Anlage 1).
1.3. BEGRIFFSBESTIMMUNGEN UND EINHEITEN

(Tabelle)

1.4. PRINZIP DER TESTMETHODE
Bodenproben mit bekanntem Trockengewicht, die vorab in 0,01 M CaCl2 in ein Gleichgewicht gebracht wor-
den sind, werden bei bekannten Konzentrationen von 0,01 M CaCl2 mit bekannten Volumina von Lösungen
der Testsubstanz, die nichtmarkiert oder radioaktiv markiert ist, versetzt. Das Gemisch wird für eine angemes-
sene Zeit geschüttelt. Anschließend werden die Bodensuspensionen mittels Zentrifugieren und, falls gewünscht,
Filtrieren getrennt, und die wässrige Phase wird analysiert. Die Menge der an der Bodenprobe adsorbierten
Testsubstanz wird berechnet als die Differenz zwischen der Anfangsmenge der Testsubstanz in Lösung und
der bei Beendigung des Versuchs verbleibenden Menge (indirekte Methode).
Wahlweise kann die Menge der adsorbierten Testsubstanz auch unmittelbar durch eine Bodenanalyse bestimmt
werden (direkte Methode). Diese Vorgehensweise, die eine schrittweise Bodenextraktion mit einem geeigneten
Lösungsmittel umfasst, empfiehlt sich in Fällen, bei denen eine präzise Bestimmung der Differenz in der
Lösungskonzentration der Substanz nicht möglich ist. Als Beispiele seien folgende Sachverhalte genannt:

Adsorption der Testsubstanz an der Oberfläche der Testgefäße, Instabilität der Testsubstanz im Zeitrahmen des
Versuchs, nur geringe Konzentrationsveränderung in der Lösung infolge einer schwachen Adsorption sowie
starke Adsorption mit dem Ergebnis einer niedrigen Konzentration, die nicht genau bestimmt werden kann.
Kommt eine radioaktiv markierte Substanz zum Einsatz, könnte die Bodenextraktion durch Analyse der
Bodenphase mittels Verbrennung und Flüssigszintillationszählung umgangen werden. Die Flüssigszintillations-
zählung ist jedoch eine unspezifische Technik, die keine Unterscheidung zwischen Ausgangs- und Umwand-
lungsprodukten erlaubt. Daher sollte sie nur dann Anwendung finden, wenn die Testchemikalie für die Dauer
der Untersuchung stabil ist.
1.5. ANGABEN ZUR TESTSUBSTANZ
Die chemischen Reagenzien sollten Analysenreinheit aufweisen. Empfohlen wird die Verwendung nichtmar-
kierter Testsubstanzen mit bekannter Zusammensetzung und von vorzugsweise mindestens 95% iger Reinheit
bzw. radioaktiv markierter Testsubstanzen mit bekannter Zusammensetzung und von radioaktiver Reinheit.
Bei Markierungssubstanzen mit kurzer Halbwertzeit sollten Zerfallskorrekturen angewendet werden.
Vor der Durchführung einer Adsorptions-/Desorptionsprüfung sollten in Bezug auf die Testsubstanz folgende
Angaben vorliegen:
a) Wasserlöslichkeit (A.6.);
b) Dampfdruck (A.4.) und/oder Henry-Konstante;
c) abiotischer Abbau: Hydrolyse als Funktion des pH (C.7.);
d) Verteilungskoeffizient (A.8.);
e) leichte biologische Abbaubarkeit (C.4.) bzw. aerobe und anaerobe Umwandlung in Boden;
f) pKa von ionisierbaren Substanzen;
g) Direktphotolyse in Wasser (d. h. UV-Vis-Absorptionsspektrum in Wasser, Quantenausbeute) und photo-
chemischer Abbau an Boden.
1.6. ANWENDBARKEIT DES TESTS
Der Test ist anwendbar auf chemische Substanzen, für die eine analytische Methode mit hinreichender Genau-
igkeit zur Verfügung steht. Ein wichtiger Kennwert, der die Verlässlichkeit der Ergebnisse beeinflussen kann,
und zwar besonders bei der indirekten Methode, ist die Stabilität der Testsubstanz innerhalb des Zeitrahmens
des Tests. Daher ist die Stabilität in jedem Falle in einer Voruntersuchung zu überprüfen. Wird im Zeitrahmen
des Tests eine Umwandlung beobachtet, so empfiehlt es sich, dass die Hauptuntersuchung durch Analysen
sowohl der Bodenphase als auch der wässrigen Phase durchgeführt wird.
Schwierigkeiten könnten sich bei der Ausführung dieses Tests bei Testsubstanzen mit geringer Wasserlöslich-
keit ergeben (Sw < 10 -4 g l -1 ), desgleichen bei hoch dosierten Substanzen, da die Konzentration in der wäss-
rigen Phase analytisch nicht mit ausreichender Genauigkeit meßbar ist. In diesen Fällen sind zusätzliche
Schritte notwendig. In den entsprechenden Abschnitten der vorliegenden Dokumentation sind Hinweise dafür
zu finden, wie sich diese Probleme lösen lassen.
Bei der Prüfung flüchtiger Substanzen ist dafür Sorge zu tragen, dass Verluste während der Behandlung ver-
mieden werden.
1.7. BESCHREIBUNG DER METHODE
1.7.1. Geräte und chemische Reagenzien
Standardlaborausstattung, insbesondere Folgendes:
a) Reagenzgläser oder Gefäße zur Versuchsdurchführung. Vor allem müssen diese Reagenzgläser oder Gefäße
Š genau in die Zentrifuge passen, um Handhabungs- und Umsetzfehler weitestgehend auszuschließen;
Š aus inertem Material bestehen, damit es möglichst nicht zur Adsorption der Testsubstanz an der
Oberfläche kommt.
(b) Schüttelwerk: Überkopfschüttler oder gleichwertige Vorrichtung; der Schüttler sollte den Boden während
des Schüttelns in Suspension halten.

(c) Zentrifuge: vorzugsweise Hochleistungsgerät, z. B. mit Zentrifugalkräften > 3 000 g, temperaturgeregelt,
fähig zur Abtrennung von Partikeln mit einem Durchmesser über 0,2 lm aus wässriger Lösung. Die
Behälter sollten während des Rührens und Zentrifugierens abgedeckt sein, um Volatilitäts- und Wasserver-
luste zu vermeiden; um einer Adsorption daran möglichst vorzubeugen, sollte auf inaktivierte Abdeckun-
gen, beispielsweise teflonbeschichtete Schraubkappen, zurückgegriffen werden.
(d) Fakultativ: Filtriervorrichtung; sterile Einweg-Filter mit einer Porosität von 0,2 lm. Mit besonderer Umsicht
ist bei der Auswahl des Filtermaterials vorzugehen, um jegliche Verluste der Testsubstanz daran zu ver-
meiden; bei schwerlöslichen Testsubstanzen wird empfohlen, kein organisches Filtermaterial zu verwen-
den.
(e) Analytische Instrumente, mit denen die Konzentration der Testchemikalie gemessen werden kann.
(f) Laborofen, mit dem sich eine Temperatur von 103 °C bis 110 °C halten lässt.
1.7.2. Charakterisierung und Auswahl von Böden
Die Charakterisierung der Böden sollte anhand von drei Parametern erfolgen, die als weitgehend verantwortlich
für das Adsorptionsvermögen betrachtet werden: der organische Kohlenstoffgehalt, der Tongehalt und die
Bodentextur sowie der pH-Wert. Wie bereits erwähnt (siehe unter Anwendungsbereich) können sich auch
andere physikalisch-chemische Eigenschaften des Bodens auf die Adsorption/Desorption einer bestimmten Sub-
stanz auswirken und sollten daher in solchen Fällen berücksichtigt werden.
Die für eine Bodencharakterisierung verwendeten Methoden sind von großer Bedeutung und können einen
erheblichen Einfluss auf die Ergebnisse ausüben. Aus diesem Grund empfiehlt es sich, den Boden-pH-Wert in
einer Lösung von 0,01 M CaCl2 (der im Adsorptions-/Desorptionstest verwendeten Lösung) gemäß der ent-
sprechenden ISO-Methode (ISO-10390-1) zu messen. Weiterhin wird empfohlen, die übrigen relevanten
Bodenmerkmale nach Standardverfahren zu bestimmen (z. B. ISO Handbook of soil analysis). Diese Vor-
gehensweise gestattet es, die Analyse von Sorptionsdaten anhand international einheitlicher Bodenparameter
vorzunehmen. Einige Anleitungen zu vorhandenen Standardverfahren der Bodenanalyse und -charakterisierung
sind den bibliographischen Angaben zu entnehmen (50-52). Zur Kalibrierung von Bodentestmethoden wird
die Verwendung von Referenzböden empfohlen.
Eine Anleitung zur Auswahl von Böden für Adsorptions-/Desorptionsversuche ist in Tabelle 1 zu finden. Mit
den sieben ausgewählten Böden werden Bodentypen erfasst, die in gemäßigten geographischen Zonen anzu-
treffen sind. Bei ionisierbaren Testsubstanzen sollten die gewählten Böden einen großen pH-Bereich abdecken,
damit die Adsorption der Substanz in deren ionisierter und nichtionisierter Form bewertet werden kann. Im
Abschnitt 1.9 —Durchführung des Testsif ist angegeben, wieviele unterschiedliche Böden in den einzelnen Pha-
sen des Tests zu verwenden sind.
Werden andere Bodentypen bevorzugt, so sollten diese nach denselben Parametern charakterisiert werden und
eine ähnliche Spannbreite an Merkmalen wie die in Tabelle 1 beschriebenen aufweisen, auch wenn sie den Kri-
terien nicht exakt entsprechen.
TABELLE 1: Anleitung zur Auswahl von Bodenproben zur Adsorption/Desorption

(Tabelle)

1.7.3. Sammlung und Lagerung von Bodenproben
1.7.3.1. Sammlung
Es werden keine speziellen Probenahmetechniken oder -hilfsmittel empfohlen. Das Probenahmeverfahren rich-
tet sich nach dem Zweck der Untersuchung (53) (54) (55) (56) (57) (58).
Folgendes ist zu beachten:
a) Es sind ausführliche Informationen über die Geschichte des Feldstandorts erforderlich, so zum Ort, zum
Bewuchs, zu Behandlungen mit Pestiziden und/oder Düngemitteln, zu biologischen Anlagerungen oder zu
unfallbedingten Verschmutzungen. Im Hinblick auf die Beschreibung des Probenahmestandorts sind die
Empfehlungen der ISO-Norm zur Entnahme von Bodenproben (ISO 10381-6) einzuhalten.
b) Der Probenahmestandort ist mittels UTM (Universale Transversale Mercator-Projektion/European Horizon-
tal Datum) oder geografischen Koordinaten zu definieren. Daraus könnte für die Zukunft die Möglichkeit
erwachsen, einen bestimmten Boden erneut zu sammeln oder Boden nach verschiedenen Klassifizierungs-
systemen zu definieren, die in unterschiedlichen Ländern benutzt werden. Außerdem sollte A-Horizont
nur bis zu einer Maximaltiefe von 20 cm gesammelt werden. Vor allem der Boden Nr. 7 sollte in die Pro-
benahme einbezogen werden, wenn ein Teil des Bodens Oh -Horizont ist.
Die Bodenproben sollten mit Hilfe von Behältern und unter Temperaturbedingungen transportiert werden, die
gewährleisten, dass die ursprünglichen Bodeneigenschaften nicht wesentlich verändert werden.
1.7.3.2. Lagerung
Bevorzugt wird die Verwendung feldfrischer Böden. Nur wenn dies nicht möglich ist, sollte Boden bei Umge-
bungstemperatur gelagert und lufttrocken aufbewahrt werden. Eine Begrenzung der Lagerzeit wird nicht emp-
fohlen, doch sollten Böden, die länger als drei Jahre gelagert wurden, vor ihrer Verwendung erneut auf ihren
organischen Kohlenstoffgehalt, pH-Wert und KAK analysiert werden.
1.7.3.3. Handhabung und Vorbereitung von Bodenproben auf den Test
Die Böden werden bei Umgebungstemperatur (vorzugsweise zwischen 20 und 25 C) luftgetrocknet. Die Auf-
lockerung sollte mit minimalem Kraftaufwand erfolgen, so dass die ursprüngliche Textur des Bodens möglichst
wenig verändert wird. Die Böden werden auf eine Partikelgröße Ä 2 mm gesiebt. Im Hinblick auf den Siebvor-
gang sollten die Empfehlungen der ISO-Norm zur Probenahme eingehalten werden (ISO 10381-6). Empfohlen
wird eine sorgfältige Homogenisierung, da dies die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse erhöht. Der Feuchte-
gehalt jedes Bodens wird an drei Aliquoten mit Erwärmung auf 105 °C bestimmt, bis keine signifikante
Gewichtsveränderung mehr zu verzeichnen ist (ca. 12 h). Bei allen Berechnungen bezieht sich die Bodenmasse
auf die Ofentrockenmasse, d. h. das um den Feuchtegehalt korrigierte Bodengewicht.
1.7.4. Vorbereitung der Testsubstanz zur Anwendung auf Boden
Die Testsubstanz wird in einer Lösung von 0,01 M CaCl2 in destilliertem oder entionisiertem Wasser gelöst.
Die CaCl2 -Lösung dient als wässrige Lösungsmittelphase zur Verbesserung der Zentrifugation und Minimierung
des Kationenaustauschs. Die Konzentration der Vorratslösung sollte die Nachweisgrenze der verwendeten ana-
lytischen Methode vorzugsweise um den Faktor 3 übersteigen. Diese Schwelle gewährleistet genaue Messungen
in bezug auf die diesem Verfahren zugrunde liegende Methodik. Darüber hinaus sollte die Konzentration der
Vorratslösung die Wasserlöslichkeit der Testsubstanz unterschreiten.
Die Vorratslösung sollte am besten unmittelbar vor Anwendung auf die Bodenproben zubereitet sowie ver-
schlossen und vor Licht geschützt bei 4 °C aufbewahrt werden. Die Lagerzeit richtet sich nach der Stabilität
der Testsubstanz und ihrer Konzentration in der Lösung.
Lediglich bei schwerlöslichen Substanzen (Sw < 10 -4 g l -1 ) könnte unter Umständen ein geeignetes Solubilisie-
rungsmittel notwendig sein, wenn sich die Testsubstanz nur schwer auflösen läßt. Ein solches Solubilisierungs-
mittel sollte a) mit Wasser mischbar sein, beispielsweise Methanol oder Acetonitril, b) in einer Konzentration
von höchstens 1 % des Gesamtvolumens der Vorratslösung und darunter in der Lösung der Testsubstanz, die
in Kontakt mit dem Boden kommt (vorzugsweise unter 0,1 %), enthalten sein und c) kein oberflächenaktiver
Stoff sein oder solvolytische Reaktionen mit der Testchemikalie durchlaufen. Die Verwendung eines Solubilisie-
rungsmittels sollte im Datenbericht festgehalten und begründet werden.
Eine andere Alternative bei schwerlöslichen Substanzen besteht darin, die Testsubstanz durch Untermischen in
ein Testsystem zu geben: Die Testsubstanz wird in einem organischen Lösungsmittel gelöst, von dem eine Ali-
quote zu dem System von Boden und 0,01 M CaCl2 -Lösung in destilliertem oder entionisiertem Wasser gege-
ben wird. Der Gehalt an organischem Lösungsmittel in der wässrigen Phase sollte so niedrig wie möglich
gehalten werden und im Regelfall 0,1 % nicht übersteigen. Beim Untermischen aus einer organischen Lösung
kann das Problem der Volumen-Nichtreproduzierbarkeit auftreten. Dadurch kann sich ein zusätzlicher Fehler
ergeben, da die Konzentrationen von Testsubstanz und Hilfslösungsmittel nicht in allen Tests gleich hoch aus-
fallen dürften.

1.8. VORAUSSETZUNGEN FÜR DIE DURCHFÜHRUNG DES ADSORPTIONS-/DESORPTIONSTESTS
1.8.1. Analysenmethode
Zu den wichtigsten Parametern, die die Genauigkeit von Sorptionsmessungen beeinflussen können, zählen die
Genauigkeit der Analysenmethode bei der Untersuchung der Lösungs- und adsorbierten Phasen, die Stabilität
und Reinheit der Testsubstanz, das Einstellen des Sorptionsgleichgewichts, das Ausmaß der Lösungskonzentra-
tionsveränderung, das Boden-Lösungs-Verhältnis sowie Veränderungen in der Bodenstruktur während des
Gleichgewichtseinstellungsprozesses (35) (59Š62). Einige Beispiele betreffend die Genauigkeitsproblematik
sind in Anlage 2 dargestellt.
Die Zuverlässigkeit der verwendeten Analysenmethode muss bei dem Konzentrationsbereich überprüft werden,
der vermutlich während des Tests auftreten wird. Es sollte im Ermessen des Experimentators liegen, eine geeig-
nete Methode mit angemessener Genauigkeit, Präzision, Reproduzierbarkeit, Gewinnungsraten und hinreichen-
den Nachweisgrenzen zu entwickeln. Eine Anleitung für die Durchführung eines solchen Tests vermittelt der
nachstehende Versuch.
Ein angemessenes Volumen 0,01 M CaCl2 , z.B. 100 cm 3 , wird mit einer Masse Boden, z. B. 20 g, hoher
Adsorptionsfähigkeit, d. h. mit hohem organischen Kohlenstoff- und Tongehalt 4 Stunden geschüttelt. Diese
Massen und Volumen können je nach Analysenanforderung variieren, doch ist ein Boden-Lösungs-Verhältnis
von 1:5 ein geeigneter Ausgangswert. Das Gemisch wird zentrifugiert, und die wässrige Phase kann filtriert
werden. Diese wird dann mit einem bestimmten Volumen der Testsubstanz-Vorratslösung versetzt, so dass
eine Nennkonzentration innerhalb des für den Testverlauf wahrscheinlichen Konzentrationsbereichs erreicht
wird. Dieses Volumen sollte 10 % des Endvolumens der wässrigen Phase nicht überschreiten, um den Charak-
ter der Lösung vor Einstellung des Gleichgewichts so wenig wie möglich zu verändern. Die Lösung wird ana-
lysiert.
Es ist ein Leerdurchlauf bestehend aus dem System Boden + CaCl2 -Lösung (ohne Testsubstanz) anzusetzen, um
unerwünschte Pseudoergebnisse in der Analysenmethode und durch den Boden hervorgerufene Matrixeffekte
zu entdecken.
Zu den für Sorptionsmessungen geeigneten analytischen Methoden gehören die Gas-Flüssigkeits-Chromatogra-
phie (GLC), Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC), Spektrometrie (z. B. GC/Massenspektrometrie,
HPLC/Massenspektrometrie) und Flüssigszintillationszählung (für radioaktiv markierte Substanzen). Unabhängig
von der verwendeten Analysenmethode gelten Gewinnungsraten zwischen 90 und 110 % des Nennwertes als
angemessen. Um eine Detektion und Evaluierung nach erfolgter Verteilung zu ermöglichen, sollten die Nach-
weisgrenzen der Analysenmethode die Nennkonzentration mindestens um den Faktor 2 unterschreiten.
Die Merkmale und Nachweisgrenzen der zur Ausführung von Adsorptionsuntersuchungen verfügbaren Ana-
lysenmethode spielen eine wichtige Rolle bei der Festlegung der Testbedingungen und der Durchführung des
Tests insgesamt. Die vorliegende Methode stützt sich auf eine allgemeinere experimentelle Vorgehensweise und
gibt Empfehlungen und Anleitung für alternative Lösungswege, die gewählt werden können, wenn sich Ein-
schränkungen aufgrund der analytischen Methode und der Laborausstattung ergeben.
1.8.2. Auswahl optimaler Boden-Lösungs-Verhältnisse
Die Auswahl geeigneter Boden-Lösungs-Verhältnisse für Sorptionsuntersuchungen richtet sich nach dem Ver-
teilungskoeffizienten Kd und dem gewünschten relativen Adsorptionsgrad. Die Veränderung der Konzentration
der Substanz in der Lösung bestimmt die statistische Genauigkeit der Messung auf der Grundlage der Form
der Adsorptionsgleichung und der Grenze der analytischen Methodik bei der Bestimmung der Konzentration
der Chemikalie in Lösung. Daher ist es in der Praxis generell von Nutzen, einige wenige feste Verhältnisse
anzusetzen, bei denen der adsorbierte Anteil oberhalb 20 % und vorzugsweise >50 % liegt (62). Gleichzeitig ist
darauf zu achten, dass die Konzentration der Testsubstanz in der wässrigen Phase so hoch ist, dass sie eine
genaue Messung erlaubt. Dies ist insbesondere im Fall hoher Adsorptionsanteile von Bedeutung.
Ein passender Ansatz für die Wahl geeigneter Boden-Wasser-Verhältnisse basiert auf einer Schätzung des Kd -
Wertes entweder mittels Voruntersuchungen oder durch etablierte Abschätzungsverfahren (Anlage 3). Die
Wahl eines geeigneten Verhältnisses kann auf der Basis einer grafischen Darstellung des Boden-Lösungs-Ver-
hältnisses in Abhängigkeit von Kd für festgelegte Adsorptionsanteile erfolgen (Abb. 1). Bei dieser Darstellung
wird angenommen, dass die Adsorptionsgleichung linear ist ( 1 ). Die anwendbare Beziehung wird durch
Umstellung der Gleichung (4) des Kd in Form der Gleichung (1) erhalten:

(Formel)

Abb. 1: Beziehung zwischen Boden-Lösungs-Verhältnissen und Kd bei verschiedenen Anteilen adsorbierter
Testsubstanz
Abb. 1 zeigt für unterschiedliche Adsorptionsebenen erforderliche Boden-Lösungs-Verhältnisse als Funktion
von Kd . Beispielsweise würde es bei einem Verhältnis Boden:Lösung von 1:5 und einem Kd von 20 zu einer
annähernd 80%igen Adsorption kommen. Um bei identischem Kd eine 50%ige Adsorption zu erzielen, ist ein
Verhältnis von 1:25 anzusetzen. Mit diesem flexiblen Ansatz kann der Untersucher das für die Versuchsanfor-
derungen jeweils geeignete Boden-Lösungs-Verhältnis wählen.
Größere Schwierigkeiten bestehen in Bereichen, in denen die Chemikalie stark oder sehr geringfügig adsorbiert
wird. Bei geringer Adsorption empfiehlt sich ein Boden-Lösungs-Verhältnis von 1:1, wenngleich bei einigen
ausgeprägt organischen Bodentypen unter Umständen niedrigere Verhältnisse erforderlich sind, um einen
Schlamm zu erhalten. Mit Sorgfalt ist bei der analytischen Methodik zur Messung geringfügiger Veränderungen
der Lösungskonzentration vorzugehen, da andernfalls die Adsorptionsmessung ungenau ausfällt. Demgegen-
über ist bei sehr hohen Verteilungskoeffizienten Kd ein Boden-Lösungs-Verhältnis von bis zu 1:100 möglich,
damit eine signifikante Menge der Chemikalie in Lösung bleibt. In jedem Fall ist auf ein gründliches Durch-
mischen zu achten. Ferner ist für die Gleichgewichtseinstellung im System eine ausreichende Zeitspanne ein-
zuplanen. Ein alternativer Ansatz besteht darin, den Kd -Wert anhand von Abschätzungstechniken vorherzu-
bestimmen, die zum Beispiel auf Pow -Werten fußen (Anlage 3). Diese Vorgehensweise könnte sich insbesondere
bei geringfügig adsorbierten/polaren Chemikalien mit Pow < 20 und für lipophile/stark sorbierende Chemika-
lien mit Pow > 10 4 als sinnvoll erweisen.
1.9. DURCHFÜHRUNG DES TESTS
1.9.1. Testbedingungen
Sämtliche Versuche werden bei Umgebungstemperatur und, falls möglich, bei einer konstanten Temperatur
zwischen 20 und 25 °C durchgeführt.
Beim Zentrifugieren sollten Partikel aus der Lösung abgetrennt werden, die größer als 0,2 lm sind. Dieser
Wert steht für die kleinsten Partikel, die als Feststoffpartikel eingestuft werden, und stellt den Grenzwert zwi-
schen Feststoff- und Kolloidpartikeln dar. In Anlage 4 ist eine Anleitung zur Bestimmung der Zentrifugierbe-
dingungen zu finden.
Ist mit den Zentrifugiervorrichtungen die Entfernung von Partikeln > 0,2 µm nicht zu gewährleisten, könnte
auf eine Kombination von Zentrifugation und Filtration mit 0,2 lm-Filtern zurückgegriffen werden. Diese Fil-
ter sollten aus einem entsprechenden inerten Material bestehen, um jegliche Verluste der Testsubstanz daran
zu vermeiden. In jedem Fall sollte nachgewiesen sein, dass es während des Abfiltrierens nicht zu Verlusten der
Testsubstanz kommt.

1.9.2. Stufe 1 Š Voruntersuchung
Der Zweck der Durchführung einer Voruntersuchung ist bereits im Abschnitt Anwendungsbereich erläutert
worden. Eine Anleitung zur Ansetzung eines solchen Tests wird anhand des nachfolgend vorgeschlagenen Ver-
suchs gegeben.
1.9.2.1. Auswahl optimaler Boden-Lösungs-Verhältnisse
Zum Einsatz kommen zwei Bodentypen und drei Boden-Lösungs-Verhältnisse (sechs Versuche). Ein Bodentyp
besitzt einen hohen organischen Kohlenstoffgehalt und einen niedrigen Tongehalt, der andere einen niedrigen
organischen Kohlenstoffgehalt und einen hohen Tongehalt. Folgende Verhältnisse werden vorgeschlagen:
Š 50 g Boden und 50 cm 3 wässrige Lösung der Testsubstanz (Verhältnis 1/1);
Š 10 g Boden und 50 cm 3 wässrige Lösung der Testsubstanz (Verhältnis 1/5);
Š 2 g Boden und 50 cm 3 wässrige Lösung der Testsubstanz (Verhältnis 1/25).
Die Mindestmenge Boden zur Ausführung des Versuchs richtet sich nach den Laboreinrichtungen und der
Leistungsfähigkeit der verwendeten analytischen Methoden. Es empfiehlt sich jedoch, mindestens 1 g, vorzugs-
weise 2 g, einzusetzen, um verlässliche Testergebnisse zu erzielen.
Eine Kontrollprobe mit lediglich der Testsubstanz in 0,01 M CaCl2 -Lösung (kein Boden) wird exakt den glei-
chen Schritten wie die Testsysteme unterzogen, um die Stabilität der Testsubstanz in CaCl2 -Lösung und ihre
mögliche Adsorption an den Oberflächen der Testgefäße zu prüfen.
Ein Leerdurchlauf je Boden mit der gleichen Menge Boden und einem Gesamtvolumen von 50 cm 3 0,01 M
CaCl2 -Lösung (ohne Testsubstanz) wird dem gleichen Testverfahren unterzogen. Dies dient während der Ana-
lyse als Leerkontrolle zurm Nachweis störender Substanzen oder kontaminierter Böden.
Sämtliche Versuche, eingeschlossen Kontroll- und Leerversuche, sollten mindestens doppelt durchgeführt wer-
den. Die Gesamtzahl der Proben, die für den Test vorbereitet werden sollten, kann mit Bezug auf die zugrunde
liegende Methodik berechnet werden.
Für Vor- und Hauptuntersuchung werden in der Regel die gleichen Methoden angewendet. Ausnahmen wer-
den, falls relevant, angegeben.
Die lufttrockenen Proben werden durch Schütteln mit einem Mindestvolumen von 45 cm 3 0,01 M CaCl2 über
Nacht (12 Stunden) vor dem Versuchstag ins Gleichgewicht gebracht. Anschließend wird mit einem bestimm-
ten Volumen der Vorratslösung der Testsubstanz auf das Endvolumen von 50 cm 3 aufgefüllt. Das zugesetzte
Volumen der Vorratslösung sollte a) 10 % des Endvolumens von 50 cm 3 der wässrigen Phase nicht überschrei-
ten, um den Charakter der Lösung vor Einstellung des Gleichgewichts möglichst wenig zu verändern; und b)
vorzugsweise in einer Anfangskonzentration der in Kontakt mit dem Boden befindlichen Testsubstanz (C0 )
resultieren, die die Nachweisgrenze der analytischen Methode mindestens um den Faktor 2 überschreitet Š
diese Schwelle gewährleistet auch bei einer starken Adsorption genaue Messungen (> 90 %) sowie später die
Bestimmung der Adsorptionsisothermen. Die Anfangskonzentration der Substanz (C0 ) sollte möglichst nicht
höher sein als die Hälfte ihrer Löslichkeitsgrenze.
Nachstehend wird ein Beispiel für die Art und Weise der Berechnung der Konzentration der Vorratslösung (Cst )
beschrieben. Angenommen wird eine Nachweisgrenze von 0,01 lg cm ¯3 und 90%ige Adsorption. Daher sollte
die Anfangskonzentration der Testsubstanz in Kontakt mit dem Boden vorzugsweise 1lg cm ¯3 betragen (zwei
Größenordnungen über der Nachweisgrenze). Unter der Voraussetzung, dass das empfohlene Höchstvolumen
der Vorratslösung zugesetzt wird, d. h. 5 bis 45 cm 3 0,01 M CaCl2 -Gleichgewichtseinstellungslösung (= 10 %
der Vorratslösung zum Gesamtvolumen der wässrigen Phase von 50 cm 3 ), sollte die Konzentration der Vor-
ratslösung 10 lg cm ¯3 betragen, d. h. die Nachweisgrenze der analytischen Methode um den Faktor drei über-
schreiten.
Der pH-Wert der wässrigen Phase sollte vor und nach Kontakt mit dem Boden gemessen werden, da er im
gesamten Adsorptionsprozeß eine wichtige Rolle spielt, insbesondere für ionisierbare Substanzen.
Das Gemisch wird bis zum Erreichen des Adsorptionsgleichgewichts geschüttelt. Die Gleichgewichtszeit in
Böden ist, da abhängig von der Chemikalie und vom Boden, stark schwankend. In der Regel ist ein Zeitraum
von 24 Stunden ausreichend (77). In der Voruntersuchung mit sequenzieller Beprobung ist ein Vermischen
über einen Zeitraum von 48 Stunden empfehlenswert (zum Beispiel 4, 8, 24, 48 Stunden). Die Analysenzeiten
sollten jedoch unter Berücksichtigung des Arbeitsplans im Labor flexibel angesetzt werden.

Für die Analyse der Testsubstanz in der wässrigen Lösung bestehen zwei Möglichkeiten: a) die Gesamtbepro-
bungsmethode und b) die Aliquotenbeprobungsmethode. Es sei besonders darauf hingewiesen, dass die
Gesamtbeprobung zwar in der Versuchsdurchführung zeitaufwendiger, die mathematische Aufbereitung der
Ergebnisse jedoch einfacher ist (Anlage 5). Allerdings liegt die Entscheidung für die jeweilige Methodik beim
Experimentator, der auch die verfügbaren Laboreinrichtungen und -mittel in Rechnung zu stellen hat.
a) Gesamtbeprobungsmethode: Proben mit dem gleichen Boden-Lösungs-Verhältnis werden vorbereitet, und
zwar so viele, wie Zeitintervalle zur Untersuchung der Adsorptionskinetik vorgesehen sind. Nach Zentrifu-
gation und, falls gewünscht, Filtration wird die wässrige Phase möglichst vollständig erhalten und nach
beispielsweise 4 Stunden gemessen. Bei der zweiten Probe erfolgt die Messung nach 8 Stunden, bei der
dritten nach 24 Stunden usw.
b) Aliquotenbeprobungsmethode: Für jedes Boden-Lösungs-Verhältnis wird lediglich eine Duplikatprobe vor-
bereitet. Bei festgelegten Zeitintervallen wird das Gemisch zur Trennung der Phasen zentrifugiert. Eine
kleine Aliquote der wässrigen Phase wird sofort auf die Testsubstanz analysiert. Anschließend wird der
Versuch mit dem ursprünglichen Gemisch fortgesetzt. Folgt auf die Zentrifugation Filtration, so sollte das
Labor für die Zentrifugation kleiner wässriger Aliquoten ausgestattet sein. Es empfiehlt sich, dass das
Gesamtvolumen der abgenommenen Aliquoten nicht höher ist als 1 % des Gesamtvolumens der Lösung,
damit sich das Boden-Lösungs-Verhältnis nicht signifikant ändert und die Masse des zur Adsorption ver-
fügbaren gelösten Stoffs während des Tests nicht abnimmt.
Der Adsorptionsanteil wird zu jedem Zeitpunkt (ti ) auf der Basis der nominellen Anfangskonzentration und
der gemessenen Konzentration zur Probenahmezeit (ti ), korrigiert um den Leerwert, berechnet. Graphische
Darstellungen von in Abhängigkeit von der Zeit (Abb. 1 Anlage 5) werden erzeugt, um das Erreichen des
Gleichgewichtsplateaus abzuschätzen ( 1 ). Der Kd -Wert bei Gleichgewicht wird ebenfalls berechnet. Ausgehend
von diesem Kd -Wert werden aus Abb. 1 geeignete Boden-Lösungs-Verhältnisse so ausgewählt, daß der Adsorp-
tionsanteil über 20 % und vorzugsweise >50 % liegt (61). Alle anwendbaren Gleichungen und Grundsätze sind
im Abschnitt Daten und Abschlußbericht sowie in Anlage 5 aufgeführt.
1.9.2.2. Bestimmung der Zeit zur Einstellung des Adsorptionsgleichgewichts und der bei Gleichgewicht adsorbierten Menge Test-
substanz
Wie bereits erwähnt, gestatten grafische Darstellungen von bzw. in Abhängigkeit von der Zeit eine Abschät-
zung des Erreichens des Adsorptionsgleichgewichts und der bei Gleichgewicht adsorbierten Menge Testsub-
stanz. Beispiele für solche graphischen Darstellungen werden in den Abb. 1 und 2 gezeigt. Die Gleichgewichts-
einstellungszeit ist die Zeit, die das System benötigt, um ein Plateau zu erreichen.
Wird bei einem speziellen Boden kein Plateau, sondern ein kontinuierlicher Anstieg festgestellt, so können
dafür Faktoren wie Bioabbau oder langsame Diffusion verantwortlich sein. Ein Bioabbau läßt sich nachweisen,
indem das Experiment mit einer sterilisierten Probe des Bodens wiederholt wird. Wird kein Plateau erreicht,
sollte der Experimentator nach anderen Phänomenen suchen, die bei seinen spezifischen Untersuchungen
beteiligt sein könnten. Zu diesem Zweck könnten entsprechende Modifizierungen an den Versuchsbedingun-
gen (Temperatur, Schüttelzeiten, Boden-Lösungs-Verhältnisse) vorgenommen werden. Die Entscheidung darü-
ber, ob das Testverfahren fortgesetzt werden soll, auch wenn es möglicherweise nicht gelingt, ein Gleichge-
wicht zu erreichen, liegt im Ermessen des Experimentators.
1.9.2.3. Adsorption an der Oberfläche des Testgefäßes und Stabilität der Testsubstanz
Einige Informationen zur Adsorption der Testsubstanz an der Oberfläche von Testgefäßen und zu ihrer Stabili-
tät lassen sich aus der Analyse der Kontrollproben ableiten. Wird ein Verfall außerhalb der Standardabwei-
chung der analytischen Methode beobachtet, könnte ein abiotischer Abbau und/oder eine Adsorption an der
Oberfläche des Testgefäßes beteiligt sein. Eine Unterscheidung zwischen diesen beiden Phänomenen kann
getroffen werden, indem die Wände des Gefäßes mit einem bekannten Volumen eines geeigneten Lösungsmit-
tels gründlich gewaschen werden und die Waschlösung auf die Testsubstanz analysiert wird. Ist keine Adsorp-
tion an der Oberfläche des Testgefäßes zu beobachten, demonstriert der Verfall eine abiotische Instabilität der
Testsubstanz. Wird Adsorption festgestellt, macht sich ein Wechsel des Materials des Testgefäßes erforderlich.
Die aus diesem Experiment gewonnenen Daten zur Adsorption an der Oberfläche der Testgefäße können
jedoch nicht direkt auf ein Boden-Lösungs-Experiment extrapoliert werden. Die Anwesenheit von Boden wird
sich auf diese Adsorption auswirken.
Zusätzliche Angaben zur Stabilität der Testsubstanz lassen sich durch Bestimmung der Stamm-Massenbilanz
im Zeitablauf ableiten. Dabei werden die wässrige Phase, Extrakte von Boden und Testgefäßwänden auf die
Testsubstanz analysiert. Die Differenz zwischen der Masse der zugesetzten Testchemikalie und der Summe der
Massen der Testchemikalie in der wässrigen Phase, Extrakte von Boden und Testgefäßwänden ist gleich der
abgebauten und/oder verdunsteten und/oder nicht extrahierten Masse. Zur Durchführung einer Massenbilanz-
bestimmung sollte das Adsorptionsgleichgewicht innerhalb der Versuchszeit erreicht worden sein.
Die Bestimmung der Massenbilanz erfolgt an beiden Böden sowie für ein Boden-Lösungs-Verhältnis je Boden,
das einen Verfall oberhalb 20 % und vorzugsweise > 50 % bei Gleichgewicht ergibt. Wenn das Experiment zur
Verhältnisfindung mit der Analyse der letzten Probe der wässrigen Phase nach 48 Stunden abgeschlossen ist,
( 1 ) Einträge der Konzentration der Testsubstanz in der wäßrigen Phase (Caq ads ) in Abhängigkeit von der Zeit könnten ferner zur Abschät-
zung des Erreichens des Gleichgewichtsplateaus verwendet werden (siehe Abb. 2 in Anlage 5).

werden die Phasen mittels Zentrifugation und, falls gewünscht, Filtration getrennt. Die wässrige Phase wird so
weitgehend wie möglich aufgefangen, und der Boden wird mit einem Extraktionslösungsmittel (Extraktions-
koeffizient mindestens 95 %) versetzt, um die Testsubstanz zu extrahieren. Empfehlenswert sind wenigstens
zwei aufeinanderfolgende Extraktionen. Die Menge Testsubstanz in den Boden- und Testgefäßextrakten wird
bestimmt und die Massenbilanz berechnet (Gleichung 10, Daten und Abschlussbericht). Fällt sie niedriger aus
als 90 %, gilt die Testsubstanz als im Zeitrahmen des Tests instabil. Dennoch könnten die Untersuchungen
weiter fortgesetzt werden, wobei dann die Instabilität der Testsubstanz zu berücksichtigen wäre. Für diesen Fall
empfiehlt es sich, beide Phasen in der Hauptuntersuchung zu analysieren.
1.9.3. Stufe 2 Š Adsorptionskinetik bei einer Konzentration der Testsubstanz
Zum Einsatz kommen fünf aus Tabelle 1 ausgewählte Böden. Hierbei wäre es von Vorteil, gegebenenfalls
einige oder sämtliche Böden, die bei der Voruntersuchung verwendet wurden, einzubeziehen. In einem solchen
Fall muss Stufe 2 für die in der Voruntersuchung benutzten Böden nicht wiederholt werden.
Die Zeit zur Einstellung des Gleichgewichts, das Boden-Lösungs-Verhältnis, das Gewicht der Bodenprobe, das
Volumen der wässrigen Phase in Kontakt mit dem Boden und die Konzentration der Testsubstanz in der
Lösung werden auf der Basis der Ergebnisse aus den Voruntersuchungen ausgewählt. Analysen sollten vorzugs-
weise nach etwa 2, 4, 6, 8 (eventuell auch 10) und 24 Stunden Kontaktzeit erfolgen. Die Rührzeit könnte auf
maximal 48 Stunden ausgedehnt werden, sollte eine Chemikalie im Zusammenhang mit den Resultaten der
Verhältnisfindung eine längere Zeit bis zum Erreichen des Gleichgewichts benötigen. Die Analysenzeiten könn-
ten jedoch flexibel angesetzt werden.
Jedes Experiment (ein Boden und eine Lösung) wird mindestens doppelt ausgeführt, um die Varianz der Resul-
tate abschätzen zu können. Bei jedem Versuch wird eine Leerprobe untersucht. Sie besteht aus dem Boden
und 0,01 M CaCl2 -Lösung ohne Testsubstanz und ist hinsichtlich Gewicht und Volumen mit den Versuchspro-
ben identisch. Zu Absicherung gegen unerwartete Ergebnisse wird eine Kontrollprobe mit lediglich der Test-
substanz in 0,01 M CaCl2 -Lösung (ohne Boden) dem gleichen Testverfahren unterzogen.
Der Adsorptionsanteil wird zu jedem Zeitpunkt und/oder Zeitintervall (gemäß den Erfordernissen) berechnet
und in Abhängigkeit von der Zeit grafisch aufgetragen. Ebenfalls berechnet werden der Verteilungskoeffizient
Kd bei Gleichgewicht sowie der auf organischen Kohlenstoff normierte Adsorptionskoeffizient Koc (für nicht-
polare organische Chemikalien).
Ergebnisse des Adsorptionskinetiktests:
Der lineare Kd -Wert ist im Allgemeinen zur Beschreibung des Sorptionsverhaltens in Boden hinreichend genau
(35) (78) und ist ein Ausdruck für die inhärente Mobilität von Chemikalien in Boden. Beispielsweise gelten
Chemikalien mit Kd Ä 1 cm 3 g ¯1 in der Regel als qualitativ mobil. In ähnlicher Weise haben MacCall et al. (16)
eine Mobilitätssystematik auf der Basis von Koc -Werten aufgestellt. Ferner gibt es Auswaschsystematiken auf
der Grundlage einer Beziehung zwischen Koc und DT-50 ( 1 ) (32) (79).
Fehleranalysenuntersuchungen (61) zufolge können Kd -Werte unterhalb 0,3 cm 3 g -1 zudem nicht genau
anhand eines Rückgangs der Konzentration in der wässrigen Phase abgeschätzt werden, und zwar auch dann
nicht, wenn das (aus Sicht der Genauigkeit) günstigste Boden-Lösungs-Verhältnis, nämlich 1:1, angewendet
wird. In diesem Fall ist eine Analyse beider Phasen, d. h. von Boden und Lösung, angeraten.
Angesichts der vorstehenden Feststellungen empfiehlt es sich, die Untersuchung des Adsorptionsverhaltens
einer Chemikalie in Boden und ihres Mobilitätspotenzials fortzusetzen, indem für diese Systeme die Adsorpti-
onsisothermen nach Freundlich bestimmt werden, bei denen eine exakte Bestimmung von Kd nach dem dieser
Testmethode zugrunde liegenden Versuchsprotokoll möglich ist. Eine genaue Bestimmung ist möglich, sofern
der aus der Multiplikation von Kd mit dem Boden-Lösungs-Verhältnis resultierende Wert größer ist als 0,3,
wenn die Messungen auf einem Konzentrationsrückgang in der wässrigen Phase beruhen (indirekte Methode),
bzw. größer ist als 0,1, wenn beide Phasen analysiert werden (direkte Methode) (61).
1.9.4. Stufe 3 Š Adsorptionsisothermen und Desorptionskinetik/Desorptionsisothermen
1.9.4.1. Adsorptionsisothermen
Zum Einsatz kommen fünf Substanzen, mit denen vorzugsweise zwei Größenordnungen abgedeckt werden.
Bei der Auswahl dieser Konzentrationen sollten die Wasserlöslichkeit und die resultierenden wässrigen Gleich-
gewichtskonzentrationen Berücksichtigung finden. Das Boden-Lösungs-Verhältnis je Boden sollte während des
Verlaufs der Untersuchung nicht verändert werden. Der Adsorptionstest wird wie vorstehend beschrieben
durchgeführt, mit dem einzigen Unterschied, dass die wässrige Phase nur einmal zu der Zeit analysiert wird,
( 1 ) DT-50: Abbauzeit für 50 % der Testsubstanz.

die notwendig ist, um ein Gleichgewicht Š wie zuvor in Stufe 2 Š bestimmt zu erreichen. Die Gleichge-
wichtskonzentrationen in der Lösung werden bestimmt, und die adsorbierte Menge wird anhand des Verfalls
der Testsubstanz in der Lösung oder nach der direkten Methode berechnet. Die je Einheit Bodenmasse adsor-
bierte Menge wird grafisch als Funktion der Gleichgewichtskonzentration der Testsubstanz aufgetragen (siehe
Abschnitt Daten und Abschlussbericht).
Ergebnisse aus dem Adsorptionsisothermenexperiment:
Von den bisher vorgeschlagenen mathematischen Adsorptionsmodellen ist die Freundlich-Isotherme das zur
Beschreibung von Adsorptionsprozessen am häufigsten verwendete Modell. Nähere Einzelheiten zur Interpreta-
tion und Bedeutung von Adsorptionsmodellen sind in der in den bibliographischen Angaben genannten Litera-
tur zu finden (41) (45) (80) (81) (82).
Anmerkung:: Es sei darauf hingewiesen, dass ein Vergleich von KF (Freundlich-Adsorptionskoeffizient)-Werten
für unterschiedliche Substanzen nur möglich ist, wenn diese KF -Werte in den gleichen Einheiten ausgedrückt
werden (83).
1.9.4.2. Desorptionskinetik
Der Zweck dieses Experiments besteht darin zu untersuchen, ob die Adsorption einer Chemikalie an einem
Boden reversibel oder irreversibel ist. Diese Information ist insofern von Bedeutung, als auch der Desorptions-
prozess eine wichtige Rolle im Verhalten einer Chemikalie in Feldboden spielt. Darüber hinaus sind Desorpti-
onsdaten nützliche Eingangsdaten für die Computermodellierung von Auswaschungen und aufgelöster Abfluss-
simulation. Wird eine Desorptionsuntersuchung gewünscht, so empfiehlt es sich, die nachfolgend beschriebene
Studie an jedem System auszuführen, bei dem im vorhergehenden Experiment zur Adsorptionskinetik eine
genaue Bestimmung von Kd möglich war.
Ähnlich wie bei der Adsorptionskinetikuntersuchung bestehen auch hier zwei Möglichkeiten zur Fortführung
des Desorptionskinetikexperiments: a) die Gesamtbeprobungsmethode und b) die Aliquotenbeprobungs-
methode. Die Wahl der zugrunde liegenden Methodik liegt im Ermessen des Experimentators, der dabei auch
die verfügbaren Laboreinrichtungen und -mittel in Rechnung stellen muss.
a) Gesamtbeprobungsmethode: Für jeden Boden, der zur Fortführung der Desorptionsstudie ausgewählt
wurde, werden so viele Proben mit dem gleichen Boden-Lösungs-Verhältnis vorbereitet wie Zeitintervalle
zur Untersuchung der Desorptionskinetik vorgesehen sind. Vorzugsweise sollten die gleichen Zeitintervalle
wie beim Adsorptionskinetikversuch Anwendung finden, doch kann die Gesamtzeit auch ausgedehnt wer-
den, falls dies zum Erreichen des Desorptionsgleichgewichts im System erforderlich ist. Bei jedem Versuch
(ein Boden, eine Lösung) wird eine Leerprobe untersucht. Diese besteht aus dem Boden und 0,01 M
CaCl2 -Lösung, ohne Testsubstanz, und ist hinsichtlich Gewicht und Volumen mit denen des Experiments
identisch. Als Kontrollprobe wird die Testsubstanz in 0,01 M CaCl2 -Lösung (ohne Boden) dem gleichen
Testverfahren unterzogen. Alle Gemische des Bodens mit der Lösung werden bis zum Erreichen des
Adsorptionsgleichgewichts geschüttelt (wie zuvor in Stufe 2 bestimmt). Anschließend werden die Phasen
mittels Zentrifugieren getrennt und die wässrigen Phasen so weit wie möglich abgenommen. Für das abge-
nommene Volumen Lösung wird mit einem gleichen Volumen 0,01 M CaCl2 ohne Testsubstanz aufgefüllt,
und die neuen Gemische werden wieder geschüttelt. Die wässrige Phase des ersten Glases wird möglichst
vollständig aufgefangen und nach beispielsweise 2 Stunden gemessen, die des zweiten Glases nach 4 Stun-
den, die des dritten nach 6 Stunden usw., bis das Desorptionsgleichgewicht eingestellt ist.
b) Aliquotenbeprobungsmethode: Nach dem Adsorptionskinetikversuch wird das Gemisch zentrifugiert und
die wässrige Phase so weit wie möglich abgenommen. Für das abgenommene Lösungsvolumen wird mit
einem gleichen Volumen 0,01 M CaCl2 ohne Testsubstanz aufgefüllt. Das neue Gemisch wird bis zur Ein-
stellung des Desorptionsgleichgewichts geschüttelt. Während dieses Zeitraums wird das Gemisch in fest-
gelegten Zeitintervallen zur Trennung der Phasen zentrifugiert. Eine kleine Aliquote der wässrigen Phase
wird sofort auf die Testsubstanz analysiert. Anschließend läuft der Versuch mit dem ursprünglichen
Gemisch weiter. Das Volumen jeder einzelnen Aliquote sollte geringer sein als 1 % des Gesamtvolumens.
Zur Aufrechterhaltung des Verhältnisses Boden:Lösung wird in das Gemisch die gleiche Menge frischer
0,01-M-CaCl2 -Lösung gegeben. Das Schütteln wird bis zum darauf folgenden Zeitintervall fortgesetzt.
Der Desorptionsanteil wird zu jedem Zeitpunkt (Dti ) und/oder Zeitintervall (DDti ) (je nach den Untersuchungs-
erfordernissen) berechnet und grafisch in Abhängigkeit von der Zeit aufgetragen. Der Desorptionskoeffizient
von Kdes bei Gleichgewicht wird ebenfalls berechnet. Alle anwendbaren Gleichungen sind im Abschnitt Daten
und Abschlussbericht sowie in Anlage 5 aufgeführt.
Ergebnisse aus dem Desorptionskinetikversuch:
Gemeinsame grafische Darstellung des Anteils an Desorption Dti und Adsorption Ati in Abhängigkeit von der
Zeit erlauben eine Abschätzung der Reversibilität des Adsorptionsvorgangs. Wird das Desorptionsgleichge-
wicht erreicht, auch wenn dies erst nach dem Zweifachen der Zeit für das Adsorptionsgleichgewicht der Fall
ist, und liegt die Gesamtdesorption bei über 75 % der adsorbierten Menge, so gilt die Adsorption als rever-
sibel.

1.9.4.3. Desorptionsisothermen
Desorptionsisothermen nach Freundlich werden an den Böden bestimmt, die im Experiment zu den Adsorpti-
onsisothermen verwendet wurde. Der Desorptionstest wird wie im Abschnitt —Desorptionskinetikin beschrieben
durchgeführt, mit dem einzigen Unterschied, dass die wässrige Phase nur einmal, und zwar bei Desorptions-
gleichgewicht, analysiert wird. Es wird die Menge der desorbierten Testsubstanz berechnet. Der Gehalt von am
Boden adsorbiert bleibender Testsubstanz wird als Funktion der Gleichgewichtskonzentration der Testsubstanz
in Lösung aufgetragen (siehe Abschnitt Daten und Abschlußbericht sowie Anlage 5).
2. DATEN UND ABSCHLUSSBERICHT
Die Zusammenstellung der Analysendaten erfolgt in Tabellenform (siehe Anlage 6). Es werden einzelne Mes-
sungen und errechnete Mittelwerte angegeben. Von Adsorptionsisothermen werden grafische Darstellungen
vorgelegt. Die Berechnungen werden wie nachfolgend beschrieben durchgeführt.
Für die Zwecke des Tests wird davon ausgegangen, dass das Gewicht von 1 cm 3 wässriger Lösung 1 g beträgt.
Das Boden-Lösungs-Verhältnis kann in den Darstellungen mit den Einheiten w/w bzw. w/vol ausgedrückt wer-
den.
2.1. ADSORPTION
Die Adsorption (Ati ) wird als der Anteil von unter den Testbedingungen am Boden adsorbierter Substanz bezo-
gen auf die zu Beginn des Tests vorhandene Menge definiert. Ist die Testsubstanz stabil und adsorbiert nicht
signifikant an der Behälterwand, so wird Ati zu jedem Zeitpunkt ti nach folgender Gleichung berechnet:

(Formel)

Hierin bedeuten:
Ati = Adsorptionsanteil zum Zeitpunkt ti (%);
ms ads (ti ) = Masse der am Boden zur Zeit ti adsorbierten Testsubstanz (lg);
m0 = Masse der Testsubstanz im Reagenzglas zu Beginn des Tests (lg).
Detaillierte Angaben zur Vorgehensweise bei der Berechnung des Adsorptionsanteils Ati für die Gesamtbepro-
bungs- und die Aliquotenbeprobungsmethode enthält Anhang 5.
Der Verteilungskoeffizient Kd ist der Quotient aus dem Gehalt der Substanz in der Bodenphase und der Mas-
senkonzentration der Substanz in der wässrigen Lösung unter den Testbedingungen, wenn das Adsorptions-
gleichgewicht erreicht wird.

(Formel)

Hierin bedeuten:
Cs ads (eq) = Gehalt der am Boden bei Adsorptionsgleichgewicht adsorbierten Substanz (lg g ¯1 )
Caq ads (eq) = Massenkonzentration der Substanz in der wässrigen Phase bei Adsorptionsgleichgewicht (lg
cm ¯3 ). Diese Konzentration wird analytisch unter Berücksichtigung der durch die Leerversuche
erhaltenen Werte bestimmt;
ms ads (eq) = Masse der am Boden bei Adsorptionsgleichgewicht adsorbierten Substanz (lg)
maq ads (eq) = Masse der Substanz in der Lösung bei Adsorptionsgleichgewicht (lg)
mBoden = Menge der Bodenphase, ausgedrückt in Trockenmasse Boden (g);
v0 = Ausgangsvolumen der wässrigen Phase in Kontakt mit dem Boden (cm 3 ).

...

2.2.2. Testbericht
Der Testbericht sollte folgende Angaben enthalten:
Š Vollständige Angaben zu den verwendeten Bodenproben, darunter:
Š geografische Angaben zum Standort (Breite, Länge);
Š Datum der Probenahme;
Š Einsatzstruktur (z. B. landwirtschaftlich genutzter Boden, Forst usw.);
Š Probenahmetiefe;
Š Sand-/Schluff-/Tongehalt;
Š pH-Werte (in 0,01 M CaCl2 );
Š organischer Kohlenstoffgehalt;
Š organischer Substanzgehalt;
Š Stickstoffgehalt;
Š C/N-Verhältnis;
Š Kationenaustauschkapazität (mmol/kg);
Š sämtliche Informationen zur Sammlung und Lagerung von Bodenproben;
Š gegebenenfalls alle für die Interpretation der Adsorption/Desorption der Testsubstanz relevanten Infor-
mationen;
Š Angaben zu den für die Bestimmung der einzelnen Parameter verwendeten Methoden;
Š Informationen zur Testsubstanz, wenn erforderlich;
Š Temperatur der Experimente;
Š Zentrifugierbedingungen;
Š zur Analyse der Testsubstanz herangezogenes analytisches Verfahren;
Š Begründung der eventuellen Verwendung eines Solubilisierungsmittels bei der Herstellung der Vorrats-
lösung der Testsubstanz;
Š Erläuterung zu Korrekturen an den Berechnungen, falls relevant;
Š Daten gemäß Formular (Anlage 6) und graphische Darstellungen;
Š sämtliche Informationen und Beobachtungen, die für die Auslegung der Testergebnisse hilfreich sind.
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ANLAGE 1
TESTPLAN

(Diagramm)

ANLAGE 2
EINFLUSS DER GENAUIGKEIT DER ANALYSENMETHODE UND DER KONZENTRATIONSVERÄNDERUNG
AUF DIE GENAUIGKEIT VON ADSORPTIONSERGEBNISSEN

...

ANLAGE 3
ABSCHÄTZUNGSVERFAHREN FÜR Kd

...

ANLAGE 4
BERECHNUNGEN ZUR FESTLEGUNG DER ZENTRIFUGATIONSBEDINGUNGEN

...

ANLAGE 5
BERECHNUNG VON ADSORPTION A (%) UND DESORPTION D (%)

...

ANLAGE 6
ADSORPTION-DESORPTION IN BÖDEN: DATENBERICHTSFORMULARE

...

................

.

2001/59/EWG • Anhang 6 • Anfang